陳曉雯 吳上志 謝娜 劉文寬 林育能 陳濤 牛學(xué)鋒 蔡勇 張亞文陳德暉

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科510120;2廣州呼吸健康研究院510120

謝娜現(xiàn)在湖南省婦幼保健院,長沙410008

閉塞性細支氣管炎 (bronchiolitis obliterans,BO)是一種累及細支氣管的慢性阻塞性肺部疾病,多見于嚴重感染、異體移植、急性肺損傷和自身免疫性疾病[1-2]。兒童BO 的發(fā)病與成人不盡相同,其發(fā)生發(fā)展多與下呼吸道感染相關(guān),被認為是急性呼吸道病毒感染后遺癥,其中1%急性毛細支氣管炎患兒可發(fā)展為感染后BO[3-4]。目前兒童BO 診斷手段不多,病理是確診的金標準,臨床更多依賴于排他性診斷,尚缺乏特異性的診斷指標?？怪行粤＜?胞 胞 漿 抗 體 (antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)是針對中性粒細胞和單核細胞胞漿成分的自身抗體,其靶抗原主要有髓過氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO) 和蛋白酶3(proteinase-3,PR3)[5]。既往對ANCA 的研究多著重于血管炎、風濕免疫性疾病,近來ANCA 所涉及的疾病范圍不斷擴大,亦有關(guān)于ANCA 在部分彌漫性間質(zhì)性肺病患者中呈陽性[6-8]的文獻報道。筆者前期非對照研究發(fā)現(xiàn)BO 患兒血清中ANCA水平異常升高[9],提示ANCA 與BO 可能存在一定的相關(guān)性。為進一步探討ANCA 在BO 中的臨床意義,本研究檢測了59 例BO 患兒血清中ANCA 的表達水平,并分析其與肺炎患兒及健康兒童的差異,現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究為前瞻性研究,通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準 (醫(yī)倫審2014第33號)。選擇2009年6月至2014年10月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科住院診斷為BO的患兒共59例為BO 組;同期于本科住院的輕癥支氣管肺炎患兒43例(輕癥肺炎組)、重癥支氣管肺炎患兒18例 (重癥肺炎組)以及同期至兒科門診體檢的正常兒童15名 (正常對照組)。BO 組診斷及納入標準:符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組兒童BO 診斷標準[10],包括 (1)急性下呼吸道感染或急性肺損傷后6周以上的反復(fù)或持續(xù)喘息、氣促或咳嗽、喘鳴、呼吸困難,對支氣管擴張劑無反應(yīng);(2)臨床表現(xiàn)與X 線胸片輕重不符,臨床癥狀重,X 線胸片多為過度通氣;(3)胸部CT 顯示馬賽克灌注征、支氣管壁增厚、支氣管擴張、肺不張;(4)肺功能示阻塞性通氣功能障礙;(5)排除其他引起喘息的阻塞性疾病,如支氣管哮喘、原發(fā)性纖毛運動障礙、囊性纖維性變、異物吸入、先天發(fā)育異常、肺結(jié)核、艾滋病和其他免疫功能缺陷病等。尚需同時滿足以下條件:(1)經(jīng)規(guī)范吸入糖皮質(zhì)激素(霧化吸入布地奈德混懸液0.5～1 mg/次,2～3次/d)治療3個月無效; (2)經(jīng)支氣管鏡行肺組織穿刺活檢,排除支氣管異物、呼吸道發(fā)育畸形、哮喘、自身免疫性疾病等。輕癥肺炎組診斷及納入標準:符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組2013年兒童社區(qū)獲得性肺炎的診斷標準[11],并同時滿足以下條件。 (1)本次發(fā)病時間小于2 周;(2)既往及本次病程中均無喘息; (3)既往無濕疹、過敏性鼻炎等病史,無家族過敏史;(4)既往無早產(chǎn)、機械通氣等病史;(5)本次病程中無低氧血癥、心力衰竭、需要呼吸機輔助通氣等重癥肺炎、大葉性肺炎等表現(xiàn);(6)本次病程中無全身激素使用史。重癥肺炎組診斷及納入標準:符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組2013年兒童重癥肺炎診斷標準[11],包括(1)一般情況差;(2)有拒食或脫水征;(3)有意識障礙;(4)呼吸頻率明顯增快,嬰兒呼吸頻率＞70次/min,年長兒呼吸頻率＞50次/min;(5)紫紺;(6)呼吸困難 (呻吟、鼻翼煽動、三凹征);(7)肺部浸潤范圍大,有多肺葉受累或≥2/3的肺受累;(8)有胸腔積液;(9)脈搏血氧飽和度≤92%;(10)有肺外并發(fā)癥。滿足上述任意一條并同時滿足以下條件:(1)既往無濕疹、過敏性鼻炎等病史,無家族過敏史;(2)既往無重癥肺炎史;(3)既往無使用免疫抑制藥物,無結(jié)核病史,無風濕免疫性疾病或腫瘤等(如腎病綜合征、血液病等)基礎(chǔ)疾病病史。正常對照組納入標準:選自本院兒科門診健康體檢兒童,有以下指標中任何一項者予以剔除。(1)最近4周有呼吸道感染病史及有任何藥物使用史;(2)兒童或家族中有慢性呼吸系統(tǒng)疾病史(如慢性支氣管炎、慢性咳嗽、哮喘、過敏性鼻炎等);(3)有風濕免疫性疾病、腎臟疾病或慢性消化系統(tǒng)(如克羅恩病)等其他系統(tǒng)疾病病史。4組兒童性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 4組兒童的一般資料

1.2 血清ANCA 的檢測方法 住院患兒均于住院首日(入院時)及最后一日 (出院時)、正常兒童于體檢當天抽取靜脈血3 ml,3 000 r/min 離心10 min (離心半徑9.4 cm),離心后取上層血清。使用美國宙斯公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒對血清樣本進行MPO-ANCA、PR3-ANCA 抗體檢測,操作過程嚴格按照試劑說明書進行,檢測儀器為酶標儀 (美國Thermo 公司)。根據(jù)校正品的平均OD450 值即可算出樣品的 MPO-ANCA、PR3-ANCA抗體濃度,計算公式為:待測樣品濃度= (待測樣品OD 值×CV 值)/校正品平均OD值。陽性判定值為≥180 AAU/ml。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。首先進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗,計量參數(shù)呈正態(tài)分布時數(shù)據(jù)以±s表示,采用獨立樣本的t檢驗進行比較;非正態(tài)分布時以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示,參考值范圍以95%CI表示,采用獨立樣本或配對樣本的秩和檢驗進行比較。計數(shù)資料用頻數(shù)(百分數(shù))表示,四格表資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組血清MPO-ANCA 表達水平的比較 入院時BO 組的MPO-ANCA 的陽性率及滴度水平均明顯高于輕癥肺炎組、重癥肺炎組及正常對照組(P值均＜0.05),而輕癥肺炎組、重癥肺炎組與正常對照組的MPO-ANCA 陽性率與滴度水平的組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。出院時BO 組的MPO-ANCA 的陽性率及滴度水平仍明顯高于輕癥肺炎組與重癥肺炎組 (P值均＜0.05),而輕癥肺炎組與重癥肺炎組的MPO-ANCA 陽性率與滴度水平的組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。BO 組、輕癥肺炎組、重癥肺炎組患兒入院時與出院時MPO-ANCA陽性率與滴度水平的組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 4組兒童MPO-ANCA 表達水平

2.2 4組血清PR3-ANCA 表達水平的比較 入院時BO 組的PR3-ANCA 的陽性率及滴度水平均明顯高于輕癥肺炎組、重癥肺炎組及正常對照組(P值均＜0.05),而輕癥肺炎組、重癥肺炎組與正常對照組的PR3-ANCA 陽性率與滴度水平的組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。出院時BO 組的PR3-ANCA 的陽性率及滴度水平仍明顯高于輕癥肺炎組與重癥肺炎組 (P值均＜0.05),而輕癥肺炎組與重癥肺炎組的PR3-ANCA 陽性率與滴度水平的組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。BO 組、輕癥肺炎組、重癥肺炎組患兒入院時與出院時PR3-ANCA 陽性率與滴度水平的組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3 討論

BO 是一種累及細支氣管的慢性阻塞性肺部疾病,1901年有學(xué)者首次報道了2例死于進行性呼吸窘 迫 的BO 患 者[12]。1973 年Gosink 等[13]報 道了52例BO 后逐漸引起人們的注意。隨著高分辨率CT、支氣管鏡技術(shù)的開展,BO 逐漸為人們所認識,對其關(guān)注與重視亦隨之提高。然而,BO 的臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果均為非特異性,高分辨率CT 提示的馬賽克灌注征僅為累及細支氣管的間接征象,許多累及小氣道疾病(如支氣管擴張、哮喘)均可以有類似的影像學(xué)征象;且兒童具有年齡小及配合度、依從性差的特點,肺功能檢查結(jié)果僅供參考,故目前兒童BO 的診斷手段不多,存在一定的局限性,可致誤診或漏診,患兒過度診治或沒有得到早期識別而致嚴重肺損傷才就診,延誤了治療時機。因此,探索BO 早期診斷與疾病監(jiān)測的生物標志物對BO 患兒診斷尤為重要。

ANCA 是針對中性粒細胞和單核細胞胞漿成分的自身抗體,被認為是抗中性粒細胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎 (anti-neutrophil cytoplasmic antibody associated with vasculitis,AAV)的主要致病因素。在原發(fā)性血管炎疾病研究中,ANCA 的滴度水平與疾病的活動性呈正相關(guān),ANCA 被視為AAV 診斷、嚴重程度以及復(fù)發(fā)預(yù)測的標志物[14-15]。早期的研究發(fā)現(xiàn)ANCA 通過激活中性粒細胞釋放大量氧自由基及蛋白水解酶,從而損傷血管內(nèi)皮細胞,導(dǎo)致血管炎的發(fā)生[16-17]。近來的文獻資料顯示,ANCA 在川崎病、潰瘍性結(jié)腸炎等多種疾病中異常升高[18-19],在肺間質(zhì)性疾病的患者中亦有報道[6-8],考慮ANCA 可能參與部分肺間質(zhì)炎癥及纖維化形成。

許多慢性肺部疾病的氣道炎癥 (包括COPD、支氣管哮喘、支氣管擴張、囊性纖維化等)以中性粒細胞參與為主,氣道中性粒細胞的數(shù)量與病情的嚴重程度密切相關(guān)。有研究顯示,肺移植后發(fā)生BO 的患者肺泡灌洗液中的中性粒細胞數(shù)目異常增加,而肺移植后未發(fā)生BO 的患者肺泡灌洗液中的中性粒細胞數(shù)目則未見明顯升高[20]。同樣地,有研究發(fā)現(xiàn)麻疹感染后BO 患者肺泡灌洗液中的中性粒細胞數(shù)目亦較正常對照組明顯升高[21]。前期研究[9]首次發(fā)現(xiàn)了BO 患兒血清ANCA 異常升高,推測在BO 患者中ANCA 通過激活肺部局灶的中性粒細胞,使其釋放大量氧自由基及蛋白水解酶,損傷小氣道上皮細胞,從而導(dǎo)致小氣道上皮脫落壞死,受損的氣道上皮異常修復(fù),在機體異常的上皮再生和組織修復(fù)過程中,狹窄阻塞氣道不斷有中性粒細胞浸潤,參與了局灶的炎癥反應(yīng)。筆者對此現(xiàn)象繼續(xù)深入研究,同時更嚴格了BO 組及對照組患兒的篩選標準,結(jié)果再次證實了MPO-ANCA 與PR3-ANCA 在BO 患兒中異常表達并持續(xù)升高,而同期住院肺炎患兒無此現(xiàn)象。由此推測,BO 與AAV 等疾病可能有相似的機體免疫異常反應(yīng)基礎(chǔ),炎癥介質(zhì)及細胞因子的高分泌是觸發(fā)BO 致病的扳機,刺激后的中性粒細胞達到一定的閾值,可使高滴度ANCA 部分或完全表達,并與之表面抗原結(jié)合,介導(dǎo)后續(xù)的一系列炎癥反應(yīng)[22]。

在本研究中,BO 組進行全身激素治療2 周、肺炎組進行普通抗感染治療后再復(fù)查血清ANCA水平,結(jié)果顯示BO 組患兒 MPO-ANCA 和PR3-ANCA的陽性率在治療后仍處于高水平,與治療前相比無明顯變化。對此,筆者推測ANCA抗體屬于IgG,而IgG 是血清中主要的抗體成分,約占血清總免疫球蛋白的75%。血清中IgG 維持時間長,消失慢,半衰期約為21 d,因此ANCA水平的下降可能需要較長的時間。此外,BO 患兒小氣道出現(xiàn)阻塞,反復(fù)的炎癥和感染相互作用使得肺組織的中性粒細胞長期定植,中性粒細胞膜表面表達的MPO、PR3 抗原可誘導(dǎo)刺激ANCA 的產(chǎn)生。因此,短期的全身糖皮質(zhì)激素抗炎治療仍無法降低ANCA 的水平,可能需經(jīng)長時間治療,組織得以修復(fù)才能減少中性粒細胞的浸潤,從而降低ANCA 抗體的水平,故日后仍需對血清中ANCA水平進行長期追蹤觀察。

表3 4組兒童PR3-ANCA 表達水平

綜 上 所 述,MPO-ANCA 及PR3-ANCA 在BO 患兒為高表達并持續(xù)較長時間,ANCA 與BO具有一定相關(guān)性,提示ANCA 可能參與了BO 的發(fā)病過程,患兒血清ANCA 持續(xù)陽性可增加BO診斷的可靠性,其作用機制及是否可作為BO 診斷的生物標志物有待進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突