鄭承志, 左麗明, 馬旺, 朱琴, 王火火, 呂頌輝, 陳亨, 黃凱旋

1. 暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心, 廣東 廣州 510632;

2. 水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室, 廣東 廣州 510632;

3. 河北省水文工程地質(zhì)勘查院, 河北 石家莊 050021

抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)是一種直徑2～3μm, 球形, 金褐色, 無細胞壁, 單個葉綠體, 細胞無鞭毛的海洋微藻, 歸屬于棕鞭藻門(Ochrophyta, 又稱褐植藻門), 海金藻綱(Pelagophyceae)(DeYoe et al, 1997; 陳楊航 等,2015)。近些年來, 抑食金球藻曾在美國、南非和中國爆發(fā)大規(guī)模的藻華, 爆發(fā)海域呈褐色, 這種現(xiàn)象稱為“褐潮”。褐潮的爆發(fā)對雙殼類動物生長繁殖可造成毀滅性的打擊。在我國河北秦皇島自2009 年首次爆發(fā)以來, 曾連續(xù)四年多次爆發(fā), 導(dǎo)致當(dāng)?shù)氐纳蓉惿L停滯甚至死亡, 造成巨大的經(jīng)濟損失(Kong et al, 2012; Zhang et al, 2012)。

造成褐潮的爆發(fā)原因是多方面的, 已有一系列生理和生態(tài)調(diào)查闡述了褐潮爆發(fā)的機制(Mulholland et al, 2002; Dong et al, 2014; Kang et al, 2018)。除了物理和化學(xué)因素, 生物間的相互作用亦是褐潮發(fā)展和浮游植物競爭的重要因素。浮游植物種類間的相互作用可有效地闡述藻華的動態(tài)變化。微藻間的相互作用不僅體現(xiàn)為微藻對資源的競爭, 并可通過釋放胞外化學(xué)物質(zhì)促進或抑制其他種類, 這一過程稱為化感效應(yīng)。在褐潮爆發(fā)期共存的多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)與抑食金球藻可通過化感作用相互抑制生長(Chen et al, 2019)。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum) 和小球藻(Chlorella vulgaris)的培養(yǎng)過濾液亦能顯著降低抑食金球藻的生長(畢相東 等, 2016; 張達娟 等, 2017)。通過藻種間的相互作用研究, 可更深入理解褐潮爆發(fā)前后浮游植物群落的動態(tài)變化, 并有助于生物抑制劑的開發(fā)(畢相東 等, 2016)。

浮游植物種類間的相互作用具有種類特異性,而抑食金球藻如何與該海域的其他赤潮爆發(fā)種的相互作用尚未可知。本文選取兩株渤海主要的赤潮爆發(fā)種中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和海洋卡盾藻(Chattonella marina), 分別作為硅藻和甲藻的代表種, 研究它們與抑食金球藻在雙藻混合和三種藻混合狀態(tài)下生長的相互作用。已有研究表明中肋骨條藻可通過化感效應(yīng)對微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)、 血 紅 哈 卡 藻(Akashiwo sanguinea)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)獲取競爭的優(yōu)勢地位(Qiu et al, 2014; Wang et al, 2017)。產(chǎn)魚毒性毒素的海洋卡盾藻亦能對鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum)和血紅哈卡藻具有化感效應(yīng)(Fernández-Herrera et al, 2016)?？紤]到主要的褐潮爆發(fā)期集中在5—8 月, 其溫度變化波動在20℃至25℃之間, 因此本文設(shè)置了兩個邊界溫度, 探討在溫變條件下生長的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

抑食金球藻秦皇島株于2011 年分離自秦皇島海域, 中肋骨條藻以及海洋卡盾藻均由暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻種室提供。藻種培養(yǎng)于溫度20℃, 光強100μmol photons m-2·s-1, 光暗周期比12h∶12h 的培養(yǎng)室中。傳代接種所用培養(yǎng)基為L1 培養(yǎng)基配方(Guillard et al, 1993), 添加至經(jīng)過濾滅菌的自然海水, 鹽度為27‰。

1.2 實驗方法

1.2.1 單種培養(yǎng)

藻種擴大培養(yǎng)后, 分別置于溫度20℃和25℃的培養(yǎng)室進行培養(yǎng), 其余培養(yǎng)條件與保種條件一致, 每個溫度處理3 組平行。三種藻的初始密度分別為: 抑食金球藻為 20×105cells·mL-1, 中肋骨條藻 為 25×105cells·mL-1, 海 洋 卡 盾 藻 為2500cells·mL-1, 不同溫度處理組的初始密度保持一致。每2d 進行細胞計數(shù)及葉綠素a 含量和葉綠素?zé)晒鉁y定。

1.2.2 共培養(yǎng)實驗

共培養(yǎng)實驗組一共分為3 組雙藻種共培養(yǎng)和1組三藻種共培養(yǎng), 具體如下: 混合1 為抑食金球藻與中肋骨條藻共培養(yǎng); 混合2 為中肋骨條藻與海洋卡盾藻共培養(yǎng); 混合3 為抑食金球藻與海洋卡盾藻共培養(yǎng); 混合4 為三種藻共培養(yǎng)?；旌咸幚碇懈髟宸N的初始細胞密度和混合比例見表1。不同混合組合分別在20℃和25℃溫度下培養(yǎng), 每個溫度處理3組平行。每2d 進行細胞計數(shù)。雖然單種培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的初始密度不同, 但所能達到的環(huán)境容量是一致的(王朝暉 等, 2010; 畢相東 等, 2016; 張達娟等, 2017), 因此單種培養(yǎng)的環(huán)境容量可與混合培養(yǎng)的進行比較。

表1 不同混合處理的初始密度和混合比例Tab. 1 Initial cell intensities and mixture ratios of various combination cultures

1.2.3 細胞生長

藻液使用魯格氏碘液固定, 固定后的藻液在光學(xué)顯微鏡(奧林帕斯, CX23, 日本)下觀察計數(shù)。其中抑食金球藻使用血球計數(shù)板, 中肋骨條藻和海洋卡盾藻使用浮游植物計數(shù)框。

1.2.4 葉綠素a 含量測定

10～20mL 藻液過濾至 GF/F 玻璃纖維濾膜(0.7μm, Whatman, 英國)上, 取濾膜至離心管內(nèi)并添加5mL 預(yù)先4℃冰箱冷卻的90%丙酮溶液。離心管由錫箔紙包裹做避光處理, 置于 4℃下提取24h。提取液使用0.22μm 濾膜過濾細胞殘渣后, 吸取2mL 于比色皿中, 在紫外-可見光分光光度計(日立, 日本)下分別測定波長為 630、647、664 和750nm 的吸光度。葉綠素a 含量(Ca, 單位: μg mL-1)的計算公式為

式中D630、D647、D664 和D750 代表波長的吸光度, 數(shù)字表示波長值。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鉁y定

2mL 藻液黑暗放置15min 后, 使用掌上水體葉綠素?zé)晒鈨xAP-C 100(PSI, 捷克)測定最大光化學(xué)效率 Fv/Fm, 儀器設(shè)置飽和光強 3000μmol photons m-2·s-1, 測定數(shù)據(jù)由FluroPen 軟件導(dǎo)出(Strasser et al,2001)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

在 Origin 2021 中使用 logistic 方程N ＝K/(1 + e(a-rt))對微藻種群增長進行非線性回歸分析。式中N 表示種群密度; t 表示時間; ɑ 表示曲線原點的相對位置, 其值取決于N0。由此計算環(huán)境容量K 和內(nèi)稟增長率r。根據(jù)公式Tp=a/r 計算曲線達到生長拐點的時間。

采用SPSS25.0 的One-way ANOVA 進行統(tǒng)計分析, P＜0.05 為差異顯著。文中繪圖采用Origin 2021繪制。

2 結(jié)果

2.1 單種培養(yǎng)

在20℃條件下, 中肋骨條藻的內(nèi)稟增長率r 最高, 為0.45, 遠高于抑食金球藻的0.24 和海洋卡盾藻的0.26(表2)。溫度提高至25℃對于細胞增長的影響是顯著的, 但影響不同微藻的方式存在差異(圖1、表2)。25℃處理對細胞增長的正面效應(yīng)主要體現(xiàn)在種群內(nèi)稟增長率r 的提升和生長拐點時間Tp的提前。抑食金球藻和海洋卡盾藻的r 均被顯著提升(P＜0.05), 中肋骨條藻的則無明顯變化(表2)。此外, 25℃下三種微藻的生長拐點時間均被提前。然而, 抑食金球藻和中肋骨條藻的環(huán)境容納量 K 在25℃下分別降低60%和14%, 并且生長曲線均呈現(xiàn)達到一定細胞密度先下降后回升的現(xiàn)象(圖1)。25℃培養(yǎng)的抑食金球藻甚至在培養(yǎng)前期(0—4d)的細胞數(shù)量也存在下降的現(xiàn)象。這表明25℃已對中肋骨條藻和抑制金球藻產(chǎn)生熱脅迫, 而其細胞密度回升為再適應(yīng)過程。溫度的變化對于海洋卡盾藻的K無明顯影響。

在抑食金球藻和中肋骨條藻中, 單位細胞的葉綠素a 含量在培養(yǎng)初期對溫度變化并不敏感, 在細胞量下降過程中出現(xiàn)升溫對其含量的促進作用, 在細胞量回升過程中開始逐步降低并低于20℃的含量。而海洋卡盾藻在25℃下的葉綠素含量一直低于20℃。溫度的上升在培養(yǎng)前中期對藻種的Fv/Fm起到促進或者無明顯的影響, 只有在培養(yǎng)后期顯著低于20℃(培養(yǎng)天數(shù)＞20d)。

表2 不同溫度和混合處理下三種藻的生長參數(shù)Tab. 2 Parameters of growth for three algae species under various temperature and combination treatments

圖1 抑食金球藻(a—c)、中肋骨條藻(d—f)和海洋卡盾藻(g—i)在不同溫度下的細胞密度、葉綠素a 含量和最大光化學(xué)效率Fv/FmFig. 1 Cell densities, cellular contents of chlorophyll a, and maximum photochemical efficiency Fv/Fm for A.anophagefferens (a-c), S. costatum (d-f), and C. marina (g-i) under different temperatures

2.2 混合培養(yǎng)

當(dāng)抑食金球藻和中肋骨條藻混合時, 即混合1,二者的生長拐點達到的時間都相較單種培養(yǎng)延長至2.5～3 倍(圖2、表2)。中肋骨條藻在前期的快速增長, 分別在第12 天和第6 天在種群數(shù)量上超越抑食金球藻; 無論溫度變化, 其r 值并未受到共培養(yǎng)的影響。隨著中肋骨條藻的種群數(shù)量的上升, 20℃下抑食金球藻也出現(xiàn)了下降又回升的現(xiàn)象。這表明在競爭中, 中肋骨條藻對于抑食金球藻的生長存在抑制效果。抑食金球藻的環(huán)境容納量相較于單種培養(yǎng)下降了近60% (20℃)～70% (25℃); 而20℃和25℃下中肋骨條藻的K 均上升了近40%。此外, 25℃單種培養(yǎng)下中肋骨條藻細胞數(shù)下降后回升的現(xiàn)象并未出現(xiàn)在共培養(yǎng)處理中。

圖2 20℃和25℃下不同混合處理下抑食金球藻、中肋骨條藻和海洋卡盾藻的細胞密度Fig. 2 Cell densities of A. anophagefferens, S. costatum and C. marina under different combinations with 20℃ and 25℃

當(dāng)中肋骨條藻和海洋卡盾藻混合時(混合2), 海洋卡盾藻的生長拐點時間約延長至1.7～2 倍, 而中肋骨條藻的約延長至2～2.25 倍。在兩個溫度處理下,中肋骨條藻的r 值均提升至0.52, 表明海洋卡盾藻的添加有助于中肋骨條藻的細胞增長。而中肋骨條藻的添加則顯著抑制海洋卡盾藻的生長, 海洋卡盾藻的K 相較于單種培養(yǎng)下降了近64% (20℃)～80%(25℃)。中肋骨條藻的K 在20℃時上升了43%, 而在25℃時下降了約48%。這表明中肋骨條藻雖然能從海洋卡盾藻的添加中獲得收益, 但僅限于20℃環(huán)境下。

當(dāng)海洋卡盾藻與抑食金球藻混合時(混合3), 海洋卡盾藻的生長拐點時間約延長至4.2～6.3 倍; 抑食金球藻的延長至約1.6 倍。在20℃下, 抑食金球藻種群數(shù)量的增長導(dǎo)致海洋卡盾藻在第12—14 天期間細胞密度約降低16 倍, 并且在第24 天完全死亡。其K 值在相較于單種培養(yǎng)下降72%。在25℃時, 海洋卡盾藻則正常生長, 并且K 值增長120%。抑食金球藻在共培養(yǎng)處理中, K 值均被抑制, 20℃和25℃分別下降50%和70%。但在25℃培養(yǎng)前期, 生長被抑制期從單種培養(yǎng)的4d 縮短至2d, 這可能得益于海洋卡盾藻的添加。

在三種藻共培養(yǎng)體系中, 中肋骨條藻仍能保持高增長率, 分別在第10 天(20℃)和第8 天(25℃)在種群數(shù)量上超過抑食金球藻。在20℃下, 中肋骨條藻的K 達到最高值, 相比較單種培養(yǎng)的增長108%, 25℃下亦增加11%。而抑食金球藻的K 達到最低值, 僅為單種培養(yǎng)的21% (20℃)和28% (25℃)。海洋卡盾藻的K 在20℃下降60%, 在25℃下降48%。兩兩共培養(yǎng)結(jié)果顯示抑食金球藻的生長均受到其他兩種藻添加的抑制, 三種藻混合則進一步提升對抑食金球藻生長的抑制率。而在25℃下則會加劇抑食金球藻種群數(shù)量的下降。中肋骨條藻作為種間競爭的優(yōu)勢種, 在其更適應(yīng)的20℃條件下可從抑食金球藻和海洋卡盾藻的添加中獲取疊加收益。

3 討論

3.1 溫度對種間競爭的影響

三種微藻的最適溫度存在差異。中肋骨條藻在20℃和25℃的內(nèi)稟生長率無明顯差異, 已有研究表明中肋骨條藻在20～25℃達到最大生長率(張磊 等,2020; 張小華 等, 2020)。但溫度的升高限制其環(huán)境容量。抑食金球藻的最適溫度為20℃, 這與中肋骨條藻的適宜溫度重疊。海洋卡盾藻則更適應(yīng)25℃。黃娟 等(2009)曾報道海洋卡盾藻在30℃條件下達到最大生長率。它的最適溫度與其他兩種藻產(chǎn)生錯位。

微藻對溫度的適應(yīng)性影響種間的相互競爭。由于中肋骨條藻和抑食金球藻均對25℃敏感, 因此海洋卡盾藻在與它們在25℃共培養(yǎng)時, 相比20℃, 其所受的環(huán)境容量下降有所緩解甚至轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M。如在20℃時抑食金球藻可導(dǎo)致海洋卡盾藻死亡, 但在25℃下, 海洋卡盾藻可正常生長, 而抑食金球藻的環(huán)境容納量抑制率從 20℃的 50%上升至 25℃的70%。此外, 由于抑食金球藻的最適溫度與中肋骨條藻高度重合, 溫度的改變并未影響中肋骨條藻對其環(huán)境容量的抑制率, 均保持在較高的60%～70%。

3.2 微藻種群競爭與策略

細胞接觸、資源競爭和化感作用被認為是微藻種間競爭的重要因素(潘克厚 等, 2007)。抑食金球藻與多種其他赤潮肇事種競爭中均處于劣勢地位,例如三角褐指藻對抑食金球藻的抑制率高達98%(張達娟 等, 2017), 小球藻的在95%～98%左右(畢相東 等, 2016)。三角褐指藻和小球藻的培養(yǎng)濾液添加實驗結(jié)果表明, 抑食金球藻處于競爭劣勢主要歸因于添加藻分泌的化感物質(zhì)能夠有效抑制其生長(畢相東 等, 2016; 張達娟 等, 2017)。已有多篇研究報道了中肋骨條藻對其他藻種的化感效應(yīng)(Matsubara et al, 2008; Nagasoe et al, 2010; Qiu et al, 2014)。亦有研究表明, 海洋卡盾藻能產(chǎn)生化感物質(zhì)抑制其他浮游植物(Qiu et al, 2011; Fernández-Herrera et al, 2016)。雖然中肋骨條藻和海洋卡盾藻的添加可有效減少抑食金球藻的環(huán)境容納量, 但是它們是否對抑食金球藻存在化感效應(yīng)尚未可知。

此外, 三種微藻共培養(yǎng)結(jié)果表明, 無論促進還是抑制均觀察到協(xié)同效應(yīng)。中肋骨條藻可以在與其他兩種藻競爭中獲益, 其環(huán)境容量在三種微藻混合培養(yǎng)時達到最大, 為對照組的208%, 其收益率與混合1(139.7%)和混合2(143.1%)的乘積199.9%相近。抑食金球藻的環(huán)境容量在三種微藻共培養(yǎng)時縮減至最低值, 僅為對照組的 21.48%, 略微高于混合1(29.7%)和混合3(51.5%)的乘積15.3%。這些結(jié)果均指向抑食金球藻在更為復(fù)雜的浮游植物群落中難以獲取優(yōu)勢地位。

自2009 年以來, 褐潮在我國的頻發(fā)說明抑食金球藻在種群競爭策略上具有復(fù)雜性和獨特性(雷蕾等, 2016)。無論溫度或共培養(yǎng)處理的變化, 中肋骨條藻均保持較高的內(nèi)稟增長率。中肋骨條藻在前期快速增長, 當(dāng)達到最大細胞密度后, 迅速進入衰亡期,為典型的r-策略者。該結(jié)果符合對小型硅藻競爭策略的描述(呂頌輝 等, 2006)。對甲藻的研究報道顯示, 如海洋卡盾藻、東海原甲藻、鏈狀亞歷山大藻等多屬于k-策略者(劉望鵬 等, 2010)。其分裂速度較慢, 但對于營養(yǎng)鹽的選擇更為多樣化, 可利用多種有機營養(yǎng)鹽, 并且對于低營養(yǎng)鹽具有較強的耐受能力。

抑食金球藻的內(nèi)稟生長率介于中肋骨條藻和海洋卡盾藻之間(表2), 單獨從內(nèi)稟生長率難以判斷抑食金球藻的競爭策略。本文實驗選用的L1 培養(yǎng)基,所提供的氮源為硝酸鹽, 而在尿素和硝酸鹽混合營養(yǎng)條件下時, 抑食金球藻優(yōu)先消耗尿素而非硝酸鹽,說明抑食金球藻在營養(yǎng)鹽選擇上更偏好有機營養(yǎng)鹽(Dong et al, 2014)。多種有機物如尿素、氨基酸、蛋白質(zhì)、殼二糖和乙酰胺均能被抑食金球藻所利用(Mulholland et al, 2002)?，F(xiàn)場海域的調(diào)查也顯示, 抑食金球藻的爆發(fā)往往出現(xiàn)在有機物濃度高的海域(Glibert et al, 2007)。海灣中的海水長時間滯留無機營養(yǎng)鹽消耗, 水體溶解有機物的累積更是為抑食金球藻提供適宜生長繁殖的營養(yǎng)鹽環(huán)境(Wilson, 1995);而硝酸鹽的添加促進非褐潮浮游植物群落的增長,抑食金球藻的相對豐度均顯著下降(Gobler et al,2002)。但抑食金球藻對營養(yǎng)鹽限制具有較強的耐受能力以及恢復(fù)能力。正面和反面的結(jié)果表明, 抑食金球藻在與非褐潮浮游植物的競爭之所以能夠取得優(yōu)勢地位, 營養(yǎng)鹽偏好的差異化是重要的影響因素,且更符合k-策略選擇的特征。

抑食金球藻的爆發(fā)通常在溫度較低的5、6 月份(15～20℃)爆發(fā), 在溫度超過25℃的7、8 月衰退(Nuzzi et al, 2004)。在藻華爆發(fā)密度較高的年份里,當(dāng)海水溫度重新降至20℃以下, 如秋、冬季, 褐潮將會再次出現(xiàn)(Gobler et al, 2002; Nuzzi et al, 2004)。共培養(yǎng)結(jié)果顯示抑食金球藻在20℃下能與海洋卡盾藻競爭中取得優(yōu)勢, 但與中肋骨條藻競爭中處于劣勢。這一結(jié)果從側(cè)面解釋了褐潮的出現(xiàn)通常在硅藻爆發(fā)之后。雖然抑食金球藻在無機氮營養(yǎng)環(huán)境下與硅藻競爭中處于劣勢, 但硅藻或其他微藻爆發(fā)使得無機氮被大量消耗, 而其衰亡過程伴隨著有機氮的增加, 有利于抑食金球藻的增長繁殖(LaRoche et al,1997; Glibert et al, 2007)。

4 結(jié)論

海洋卡盾藻和中肋骨條藻添加均可對抑食金球藻的生長造成不同程度的抑制, 而中肋骨條藻則在與其他兩種藻混合中獲益。微藻對溫度的適應(yīng)程度 影響微藻種間競爭。