龔劍萍 朱凌波 羅忠禮 倪市毛 季寧寧 龔心琰

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生的重要病理、生理基礎(chǔ)[1-2]，而氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-4]，該分子能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，使得脂質(zhì)成分、炎癥細(xì)胞在損傷局部區(qū)域浸潤(rùn)并逐步形成粥樣斑塊。因此，減輕ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是目前公認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)靶點(diǎn)[5-6]。新型自組裝短肽（self-assembling peptide，SAP）是一種新興的多功能生物材料，可通過(guò)形成三維結(jié)構(gòu)，在炎性細(xì)胞的黏附、遷移及血管形成等生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。他汀類(lèi)藥物（3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑）是目前臨床上最有效的降脂藥物之一，能抑制動(dòng)脈粥樣硬化與血栓形成[8-9]。相較于傳統(tǒng)的他汀類(lèi)藥物，他汀類(lèi)藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽（statins self-assembling peptide，statins-SAP）對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的效能是否存在差異以及其分子作用機(jī)制如何，目前鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），以探討statins-SAP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)及分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑HUVEC細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心（國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)）。statins-SAP由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院羅忠禮課題組合成。ox-LDL（批號(hào)：20605ES05）、Annexin V-Alexa Fluor 488/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：40305ES20）、Mouse二抗抗體（批號(hào)：33201ES60）均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/Notch信號(hào)通路抑制劑LY450139（美國(guó)化學(xué)文摘服務(wù)社編號(hào)：425386-60-3）購(gòu)自美國(guó)MCE公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8；批號(hào)：C0043）、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒（批號(hào)：C1090）均購(gòu)自Beyotime生物技術(shù)有限公司。B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號(hào)：ab32124）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2；批號(hào)：ab237634）、Bax（批號(hào)：ab32503）、Notch1的一抗抗體（批號(hào)：ab52627）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，洛伐他汀原料藥（美國(guó)化學(xué)文摘服務(wù)社編號(hào)：1370600）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的一抗抗體（批號(hào)：A5441）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Bcl-2、VEGF、VEGFR-2、Bax、Notch1、DLL4引物由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為T(mén)hermo-Fisher Forma 311；共聚焦顯微鏡（型號(hào)：Zeiss LSM 880）購(gòu)自德國(guó)蔡司公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：DM il）購(gòu)自上海Leica公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACS CaliburⅢ）購(gòu)自美國(guó)BD Falcon公司；多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy LX）購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；蛋白質(zhì)印跡電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：e-Blot 100）購(gòu)自德國(guó)易勃特生物科技有限公司；超微量分光光度計(jì)（型號(hào)：Nan-oDrop-One）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；聚核酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀（型號(hào)：Life ECO）購(gòu)自杭州博日公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚核酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀（型號(hào)：ABI7500）購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

表1 各基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理HUVEC傳代、擴(kuò)增得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后分為5組，并給予相應(yīng)的處理：（1）對(duì)照組用含磷酸鹽緩沖液的DMEM完全培養(yǎng)基（含ox-LDL、statins-SAP及Notch信號(hào)通路的阻斷劑）培養(yǎng)；（2）ox-LDL組用含200 mg/L ox-LDL的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（3）洛伐他汀組用含200 mg/L ox-LDL+10 mg/L洛伐他汀原料藥的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（4）statins-SAP組用含200 mg/L ox-LDL+150 mg/L statins-SAP的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（5）信號(hào)通路組用含200 mg/L ox-LDL+150 mg/L statins-SAP+25 μmol/L LY450139的DMEM完全培養(yǎng)基處理。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，各實(shí)驗(yàn)組處理48 h時(shí)各表型均較為顯著。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)HUVEC接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，8 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況；加入ox-LDL、statins-SAP、洛伐他汀原料藥、LY450139等試劑后，分別于0、24、36、48、72 h加入CCK-8（10 μL/孔）；然后置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；使用多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（OD450）值，減去空白孔（僅加入DMEM和CCK-8）的OD450值，繪制各時(shí)間點(diǎn)不同處理組OD450值變化曲線圖。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)采用劃痕法。HUVEC接種、貼壁且融合度約為95%后開(kāi)始劃痕，在劃痕兩側(cè)劃線標(biāo)記細(xì)胞遷移起始位置。加入ox-LDL、statins-SAP、洛伐他汀原料藥等試劑處理48 h后行結(jié)晶紫染色。4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，加入結(jié)晶紫染色液（400 μL/孔）孵育3 min，ddH2O洗滌，找到劃痕起始線的位置，使用顯微鏡自帶的成像系統(tǒng)開(kāi)始拍攝。每孔隨機(jī)選擇3個(gè)視野，每組選擇3個(gè)培養(yǎng)孔，按照片標(biāo)尺與劃痕起始線計(jì)算遷移距離。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)采用TUNEL法。HUVEC接種、貼壁且融合度為80%后，加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等試劑處理48 h；按TUNEL試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)流程處理各組，加入抗熒光猝滅液進(jìn)行封片，在共聚焦熒光顯微鏡下使用550 nm的激發(fā)光（Cy3激發(fā)波長(zhǎng)550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)570 nm）進(jìn)行觀察，在高倍視野下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)并拍照留存，計(jì)算凋亡率。

1.2.5 蛋白表達(dá)檢測(cè)采用蛋白質(zhì)印跡法。HUVEC接種、貼壁且融合度為60%后，加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等試劑處理48 h；加入250 μL含1 mM苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量[稀釋10倍，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)562 nm處的吸光度（OD562）值]；配制對(duì)應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠（SDS蛋白膠）、蛋白marker和待檢測(cè)樣品并點(diǎn)入凝膠內(nèi)，采用70～120 V的恒壓模式進(jìn)行電泳，待目的條帶電泳至分離膠中間結(jié)束電泳。300 mA恒電流120～160 min進(jìn)行聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印結(jié)束后做好標(biāo)記；加入Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1、β-actin一抗；次日回收一抗，加入各自對(duì)應(yīng)的二抗；回收二抗，洗膜后每張膜加入混合好的化學(xué)發(fā)光液，在e-Blot成像儀中曝光得到蛋白條帶（壓片式）。使用Image-J軟件掃描各條帶灰度值，根據(jù)灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 基因表達(dá)檢測(cè)采用qPCR。HUVEC接種、貼壁且融合度為80%后，加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等試劑處理48 h；Trizol法提取細(xì)胞總RNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及A260/A280。確認(rèn)各樣本RNA合格后，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，將得到的cDNA進(jìn)行qPCR。以β-actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因（Bcl-2、VEGF、VEGFR-2、Bax、Notch1、DLL4）相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0和Graph-Pad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采取LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，洛伐他汀組和statins-SAP組細(xì)胞活力均明顯升高（均P＜0.05），且statins-SAP組高于洛伐他汀組（P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號(hào)通路組組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；在48 h時(shí)變化較為明顯，見(jiàn)表2。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移能力比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞遷移能力明顯下降（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，洛伐他汀組細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；與洛伐他汀組比較，statins-SAP組細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

表2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力（OD450）比較

圖1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移能力比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類(lèi)藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；A：細(xì)胞遷移距離比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，△P＜0.05；與洛伐他汀組比較，▲P＜0.05；B：48 h時(shí)細(xì)胞劃痕恢復(fù)情況，×20）

2.3 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，statins-SAP組細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號(hào)通路組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類(lèi)藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；A：細(xì)胞凋亡率比較，與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與ox-LDL組相比，△P＜0.05；與statins-SAP組相比，▲P＜0.05；B：48 h時(shí)細(xì)胞凋亡情況，×20）

2.4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中VEGF/Notch通路基因表達(dá)比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中VEGF/Notch通路基因表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞中Bcl-2、VEGF、VEGFR-2基因相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05）；與ox-LDL組比較，statins-SAP組細(xì)胞中Bax、Notch1、DLL4基因相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號(hào)通路組細(xì)胞中Bcl-2、VEGF、VEGFR-2基因相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中VEGF/Notch通路基因表達(dá)比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類(lèi)藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2；VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；VEGFR-2為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，△P＜0.05；與statins-SAP組比較，▲P＜0.05）

2.5 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞中Bax、Notch1的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；與ox-LDL組比較，statins-SAP組細(xì)胞中Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），Bax、Notch1的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號(hào)通路組細(xì)胞中Bax、Notch1的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類(lèi)藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2；VEGFR-2為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，△P＜0.05；與statins-SAP組比較，▲P＜0.05）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化可由ox-LDL刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞引起內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致?lián)p傷局部伴隨炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、大量脂質(zhì)沉積，逐步形成粥樣斑塊[4-5]。因此，減輕ox-LDL引起的血管內(nèi)皮損傷對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化具有重要的意義。SAP具有良好的生物相容性、生物活性，易于修飾改造[10-11]，能夠通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用形成功能性納米結(jié)構(gòu)，具有較好的藥物負(fù)載能力和環(huán)境響應(yīng)性，目前被廣泛用于藥物的精確遞送[12]。他汀類(lèi)藥物能通過(guò)降低血脂水平起到有效治療動(dòng)脈粥樣硬化性血管病的作用，但是分子結(jié)構(gòu)和理化特性對(duì)其在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等方面的作用造成了一定的局限性[8-9]。因此，可以將他汀類(lèi)藥物基團(tuán)修飾在SAP上，借助SAP充分發(fā)揮藥物優(yōu)勢(shì)。為了明確statins-SAP在ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷中的作用，本實(shí)驗(yàn)以ox-LDL刺激的HUVEC作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移能力發(fā)現(xiàn)HUVEC在受ox-LDL刺激后，細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移能力均明顯下降，說(shuō)明ox-LDL能夠誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生損傷。在ox-LDL作用的基礎(chǔ)上，筆者給予他汀類(lèi)藥物和statins-SAP進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)與洛伐他汀組比較，statins-SAP在細(xì)胞活力及遷移能力方面顯示出更好的保護(hù)效應(yīng)，其逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷更顯著。

研究證實(shí)，VEGF是一種能在血管損傷和再生過(guò)程中發(fā)揮作用的生長(zhǎng)因子[13-14]，主要通過(guò)VEGFR發(fā)揮作用；還可以介導(dǎo)Notch1/DLL4信號(hào)來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化為頂端細(xì)胞[15-17]，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附及微血管網(wǎng)絡(luò)的生成[18]；還可以調(diào)控某些信號(hào)通路，如通過(guò)VEGF/Notch1信號(hào)通路來(lái)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[19]。VEGF/Notch1信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖的重要信號(hào)通路，多種生長(zhǎng)因子能夠刺激VEGF/Notch1信號(hào)通路中的Bax、Bcl-2發(fā)生磷酸化和甲基化，然后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)使Bcl-2等抗凋亡基因表達(dá)增多，Bax等促凋亡基因表達(dá)減少，最終促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ox-LDL刺激后的HUVEC中Bax、Notch1表達(dá)明顯降低，而statins-SAP干預(yù)后，細(xì)胞中Bax、Notch1表達(dá)明顯升高，說(shuō)明ox-LDL能夠抑制HUVEC中的VEGF/Notch1信號(hào)通路，而statins-SAP能激活該通路，這可能是statins-SAP發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制與作用途徑。為了驗(yàn)證這一設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)使用VEGF/Notch1信號(hào)通路抑制劑LY450139與statins-SAP聯(lián)合作用于HUVEC，結(jié)果顯示statins-SAP能增強(qiáng)細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，削弱調(diào)節(jié)基因表達(dá)的效應(yīng)，說(shuō)明VEGF/Notch1信號(hào)通路的激活可介導(dǎo)statins-SAP減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，statins-SAP通過(guò)激活VEGF/Notch信號(hào)通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其作用效果較他汀類(lèi)藥物單獨(dú)作用更顯著。今后可以進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證statins-SAP對(duì)血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)及對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防或延緩作用，有望為動(dòng)脈粥樣硬化的臨床治療提供新的思路。