劉皓皓　劉芹　崔筱　靳榮線　高玉千　李亞楠　孔維麗　裴瑞杰　邱立友

摘 要：為了解發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中微生物代謝產(chǎn)物的組成和變化規(guī)律，采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，檢測分析發(fā)酵2、4、6、8和10 d時(shí)培養(yǎng)料的代謝組數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：在正離子（POS）模式下，分別在T2 vs T1、T3 vs T2、T4 vs T3和T5 vs T4中篩選得到331、145、161和115種差異代謝物;在負(fù)離子（NEG）模式下，分別篩選得到251、159、106和76種差異代謝物。這些差異代謝物主要包括糖類及其衍生物、氨基酸、肽類及其類似物、脂肪酸類、維生素類、苯丙素類和聚酮類物質(zhì)及其他次級代謝產(chǎn)物。此外，在發(fā)酵培養(yǎng)料中還含有植物生長調(diào)節(jié)劑（如吲哚-3-乙酸、茉莉酸和赤霉素）和抑菌物質(zhì)（如綠原酸、抗生素、白藜蘆醇）。該研究可為制備質(zhì)量穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)料和掌握發(fā)酵培養(yǎng)料栽培平菇技術(shù)提供參考。

關(guān)鍵詞：平菇;發(fā)酵料;代謝組學(xué);差異代謝物

中圖分類號：S646.1+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）04-021-10

Abstract： Non-targeted metabolomics technique was used to reveal the dynamic changes in the composition and variation of microbial metabolites in corncob composting for preparing cultivation medium of Pleurotus ostreatus. Results showed that 331， 145， 161 and 115 differential metabolites at POS mode were screened， including carbohydrates and derivants， amino acids， peptides， and analogues， fatty acids， vitamins， phenylpropanoids and polyketides， and other secondary metabolites， between T2 vs T1， T3 vs T2， T4 vs T3 and T5 vs T4， respectively. And 251， 159， 106 and 76 differential metabolites at NEG mode were screened， respectively. Furthermore， the fermentation materials contained plant growth regulators （such as indole-3-acetic acid， jasmonic acid and gibberellin） and antibacterial substances （such as chlorogenic acid， antibiotics， resveratrol）. This study provided a reference for the preparation of quality-stable fermentation materials and the further understanding of the cultivation of Pleurotus ostreatus with fermentation materials.

Key words： Pleurotus ostreatus; Fermentation material; Metabolomics; Differential metabolites

平菇Pleurotus ostreatus （Jacq.） P. Kumm.，是世界上栽培最廣泛的食用菌之一[1-3]，也是重要的食藥用真菌[4-5]。平菇的栽培技術(shù)主要有3種：生料栽培、熟料栽培和發(fā)酵料栽培[6]。與生料和熟料栽培相比，發(fā)酵料栽培平菇由于具有低污染、低成本、工藝簡單和經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點(diǎn)而在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用[6]。平菇栽培用發(fā)酵料是以秸稈、玉米芯等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物為主要原料，加入少量的麩皮、石灰等，在微生物的參與下，經(jīng)短期、好氧發(fā)酵而制備的[3]。玉米芯約占玉米產(chǎn)量的21%，是一種產(chǎn)量巨大的農(nóng)副產(chǎn)品，來源廣泛、價(jià)廉易得[7]。目前，玉米芯除用于制備糠醛、木糖醇等外，很大一部分被作為農(nóng)業(yè)廢棄物直接燃燒，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。玉米芯組織均勻、硬度適宜、吸水性強(qiáng)，將其堆制發(fā)酵后用于平菇栽培，不僅有助于平菇產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，而且可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的高效生物轉(zhuǎn)化[8]。

筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：平菇玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中，變形菌門Proteobacteria在早期階段（T1）占優(yōu)勢（相對豐度35.67%～44.10%），在高溫階段（T2，T3），厚壁菌門Firmicutes成為新的優(yōu)勢門（相對豐度41.50%～48.52%），而在堆肥后期（T4、T5），變形菌門重新成為優(yōu)勢門（相對豐度33.55%～36.89%）[9]。這些微生物對發(fā)酵過程中植物秸稈中木質(zhì)纖維素的降解起著至關(guān)重要的作用。Pearson相關(guān)分析表明，發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中的理化性質(zhì)變化與其中微生物菌落的組成變化顯著相關(guān)[9]。微生物能將培養(yǎng)料中復(fù)雜的有機(jī)質(zhì)（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等）進(jìn)行降解，使其變成簡單、易于利用的低分子物質(zhì);有些特定微生物如Actinobacteria、Thermus和Bacillus還可以產(chǎn)生抗菌、殺蟲的物質(zhì)，這可能是發(fā)酵培養(yǎng)料栽培平菇可以采用開放式接種的原因之一[10]。

目前對玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料的研究主要集中在栽培平菇[11-13]和制備過程中發(fā)酵培養(yǎng)料中微生物及其功能的演替方面[3]，而對玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中微生物代謝產(chǎn)物的研究還未見報(bào)道。代謝組學(xué)（metabolomics）是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后出現(xiàn)的新興組學(xué)技術(shù)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[14]。代謝組學(xué)是從整體角度出發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代檢測技術(shù)對盡可能多的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測[15]。目前，代謝組學(xué)在真菌領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛，為人們提供了一個(gè)了解真菌代謝的獨(dú)特途徑[14-16]。

因此，筆者通過采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析檢測玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中發(fā)酵微生物代謝產(chǎn)物的種類和含量，進(jìn)而探討制備過程中主要代謝物的組成及變化規(guī)律，為穩(wěn)定發(fā)酵料質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵料

發(fā)酵料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為：玉米芯84%，麩皮10%，石灰5%，尿素1%;含水量68%。

1.2 試劑與儀器

玉米芯（中值粒徑0.5 cm）、麩皮、石灰、尿素均購自本地農(nóng)貿(mào)市場;LC-MC級甲醇、水、甲酸、醋酸銨（CNW Technologies GmbH， Germany）。

BSA124S-CW天平（Sartorius）;1290 UHPLC 色譜儀（Agilent Technologies Inc.， USA）;Triple TOF 6600質(zhì)譜儀（AB Sciex Pte. Ltd.， USA）;D3024R高速冷凍離心機(jī)（Scilogex， USA）;JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;GWB-1普析純水儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;KS-7200DV超聲儀（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.3 發(fā)酵料制備和取樣

該試驗(yàn)于2020年3—4月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地進(jìn)行。根據(jù)以往的報(bào)道[12]，制備平菇發(fā)酵料。發(fā)酵料制備試驗(yàn)包含6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含250 kg原料（干質(zhì)量）。玉米芯原料按照質(zhì)量比為1∶2.4～2.5的料水配制，機(jī)械攪拌30 min，堆置1 d后進(jìn)行建堆，堆高60 cm，寬1.5 m左右，長度不限。此時(shí)培養(yǎng)料的含水量約為70%，pH值9～10，顏色為金黃色。用直徑5 cm的木棒在料堆上部、橫豎間隔30～40 cm打通風(fēng)孔，木棒要求插到料堆底部。發(fā)酵周期為10 d，第3天溫度升至45～55 ℃開始翻堆，培養(yǎng)料溫度升至70 ℃以上每隔1 d翻堆1次，共4次，直至發(fā)酵完成。分別在發(fā)酵2、4、6、8、10 d時(shí)采集樣品，標(biāo)注為T1、T2、T3、T4、T5。為了獲得具有代表性的樣本，分別從發(fā)酵料堆的9個(gè)不同位置采集子樣本，然后將子樣本進(jìn)行混合得到一個(gè)樣本[3]。

1.4 代謝組學(xué)分析

取發(fā)酵培養(yǎng)料樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，按北京諾禾致源科技股份有限公司非靶向代謝組學(xué)分析方法提取代謝物、超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析代謝物，采用ProteoWizard和XCMS軟件對代謝組下機(jī)數(shù)據(jù)（.raw）實(shí)施峰的識別、提取、積分及對齊等處理，利用mzCloud（https：//www.mzcloud.org/）、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰比對，同時(shí)采用blank樣本去除背景離子，進(jìn)一步進(jìn)行峰面積的批次歸一化和自適換算標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而得到代謝物的鑒定和定量結(jié)果。采用SIMCA軟件（version 14.1， sartorius stedim data analytics AB， Umea， Sweden）對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2016進(jìn)行記錄整理，采用SPSS（version 20.0）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析以及單因素ANOVA檢驗(yàn)比較平均值，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果p<0.05為差異性顯著，試驗(yàn)結(jié)果用平均值和SEM表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)料代謝物的主成分分析

基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對發(fā)酵2、4、6、8、10 d的培養(yǎng)料樣品進(jìn)行檢測，分別在正離子（POS）和負(fù)離子（NEG）模式下鑒定得到1208和472種代謝物，對所有代謝物進(jìn)行PCA分析（圖1）。從圖1可以看出，培養(yǎng)料樣品中的代謝物分成5組，組內(nèi)樣本均集聚良好，這說明5組培養(yǎng)料樣品的微生物代謝物具有顯著的差異。

為更充分地提取不同發(fā)酵時(shí)期培養(yǎng)料樣品中代謝物的差異信息，分析篩選不同組間的差異代謝物，因此進(jìn)一步采用有監(jiān)督的OPLS‐DA分析數(shù)據(jù)。由圖2可知，T2 vs T1（圖2-A～B）、T3 vs T2（圖2-C～D）、T4 vs T3（圖2-E～F）、T5 vs T4（圖2-G～H）中的樣品點(diǎn)均分布在不同的區(qū)域且明顯分為兩個(gè)簇，實(shí)現(xiàn)了兩組樣品間的完全分離。結(jié)果表明，不同發(fā)酵時(shí)期培養(yǎng)料樣品中微生物代謝產(chǎn)物在種類和（或）含量上存在明顯差異。POS模式下T2 vs T1、T3 vs T2、T4 vs T3、T5 vs T4的OPLS‐DA模型質(zhì)量參數(shù)分別為：R2Y（cum）=1.00，Q2Y（cum）=0.99;R2Y（cum）=1.00，Q2Y（cum）=0.99;R2Y（cum）=1.00，R2Y（cum）=0.98;R2Y（cum）=1.00，Q2Y（cum）=0.95。NEG模式下分別為：R2Y（cum）=1.00，Q2Y（cum）=0.99;R2Y（cum）=1.00，Q2Y（cum）=0.99;R2Y（cum）=1.00，Q2Y（cum）=0.98;R2Y（cum）=0.99，Q2Y（cum）=0.97。R2Y和Q2Y均大于0.5，這表明依據(jù)兩種采集模式所得數(shù)據(jù)建立的OPLS‐DA模型都具有較好的擬合性和較強(qiáng)的預(yù)測能力。

同時(shí)采用200次響應(yīng)的置換檢驗(yàn)來驗(yàn)證模型的過擬合現(xiàn)象，避免采用OPLS-DA方法分析時(shí)出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。由圖3可知，Q2的回歸直線與y軸的交點(diǎn)均在負(fù)半軸。POS模式下，T2 vs T1的R2Y（cum）（0，0.81），Q2（cum）（0，-0.68）;T3 vs T2的R2Y（cum）（0，0.91），Q2（cum）（0，-0.67）;T4 vs T3的R2Y（cum）（0，0.90），Q2（cum）（0，-0.67））;T5 vs T4的R2Y（cum）（0，0.91），Q2（cum）（0，-0.73）。NEG模式下，T2 vs T1的R2Y（cum）（0，0.51），Q2（cum）（0.0，-0.85）;T3 vs T2的R2Y（cum）（0，0.83），Q2（cum）（0，-0.74）;T4 vs T3的R2Y（cum）（0，0.83），Q2（cum）（0，-0.79）;T5 vs T4的R2Y（cum）（0，0.81），Q2（cum）（0，-0.87）。這說明建立的OPLS‐DA模型是穩(wěn)健可靠的，不存在過擬合現(xiàn)象。因此，可以用來探索發(fā)酵培養(yǎng)料制備過程中，不同發(fā)酵階段培養(yǎng)料樣品中的微生物代謝產(chǎn)物的差異。

2.2 發(fā)酵料制備過程中的差異代謝物的篩選

以p<0.05和VIP>1為條件篩選出具有差異性表達(dá)的化合物，T2 vs T1、T3 vs T2、T4 vs T3、T5 vs T4，在POS模式下，分別得到331、145、161和115種差異代謝物;在NEG模式下，分別得到251、159、106和76種差異代謝物（圖4）。

對檢測到的代謝物進(jìn)行l(wèi)og2處理后，在POS和NEG模式下變化最顯著的20種（上調(diào)和下調(diào)）差異代謝物見表1。T2 vs T1時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)料樣品中1-（2-呋喃基）戊烷-1，4-二酮、2-（4-氯苯基）-N，N-二甲基乙硫酰胺、D-氨基葡萄糖、N-（4-氯苯基）-N'-（2-苯氧基苯基）等物質(zhì)相對含量顯著增加;D-（+）-麥芽糖、5-羥賴氨酸、D-棉子糖、α，α-海藻糖等物質(zhì)相對含量顯著降低。T3 vs T2時(shí)，截短側(cè)耳素、圣草酚、苯乙醛等物質(zhì)相對含量顯著增加;而黑色素、縮二脲、丁酸賴氨酸等物質(zhì)相對含量顯著降低。T4 vs? T3時(shí)，阿魏酸、黃豆苷元、橙皮素等物質(zhì)相對含量顯著增加;對香豆酰胍丁胺、兒茶酚、原兒茶酸等物質(zhì)相對含量顯著降低。T5 vs T4時(shí)，L-正亮氨酸、7-羥基香豆素、環(huán)氧霉素等物質(zhì)相對含量顯著增加;兒茶酚、茶堿、2-氨基-1，3，4-十八碳三醇等物質(zhì)相對含量顯著降低。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)期差異代謝物含量比較

對不同差異代謝物進(jìn)行歸類，T2和T1、T3和T2、T4和T3、T5和T4的之間的差異代謝物的比較見圖5。在不同發(fā)酵時(shí)間的樣品中檢測出的差異代謝物主要有：糖類及其衍生物（棉子糖、蔗糖、核糖、乳糖、氨基葡萄糖、阿拉伯糖醇等），脂肪酸類（壬酸、戊酸、己酸、辛酸、順式5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、16-羥基十六烷酸等），氨基酸、肽類及其類似物（N-乙?；於彼?、甘氨酰-L-亮氨酸、L-谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸等），維生素類（生物素、核黃素、煙酸、泛酸、吡哆醇等），抑菌物質(zhì)類（綠原酸、截短側(cè)耳素、土霉素、環(huán)氧霉素、橙皮素、白藜蘆醇等），苯丙素類和聚酮類物質(zhì)（3-（4-羥基苯基）丙酸、柚苷二氫查耳酮、香豆素、3，4-二羥基苯基丙酸等），核苷、核苷酸及類似物（黃嘌呤、尿苷、cGMP、鳥苷一磷酸、脫氧胞苷等）和其他代謝物（6β-羥基皮質(zhì)醇、對香豆酰胍丁胺、1-（4-溴苯基）2-苯基乙-1-酮等）等。從代謝組數(shù)據(jù)中提取上述物質(zhì)的相對峰面積，峰面積與含量成正比，可以用來表征代謝物的含量。其中糖類及其衍生物和氨基酸、肽類及其類似物的變化趨勢相似，T2 vs? T1和T3 vs T2，糖類及其衍生物的相對含量分別下降了5.00%和4.83%，而氨基酸、肽類及其類似物相對含量分別下降了3.36%和5.92%;T4 vs T3和T5 vs T4，糖類及其衍生物的相對含量分別上升了2.43%和5.05%，而氨基酸、肽類及其類似物相對含量分別上升了1.54%和6.03%。與T1相比，T2時(shí)期發(fā)酵培養(yǎng)料中的苯丙素類和聚酮類物質(zhì)相對含量下降了4.39%，而T3、T4和T5時(shí)的苯丙素類和聚酮類物質(zhì)相對含量分別比發(fā)酵前一時(shí)期（T2、T3和T4）高9.47%、0.91%和3.15%。抑菌物質(zhì)和維生素類的相對含量均較發(fā)酵前一時(shí)期有所增加，其中T2、T3、T4和T5發(fā)酵料中抑菌物質(zhì)相對含量較T1、T2、T3和T4分別上升了7.28%、13.84%、3.83%和3.81%;而維生素類相對含量分別上升了0.14%、13.66%、6.96%和4.77%。

2.4 不同發(fā)酵時(shí)期植物生長調(diào)節(jié)劑豐度變化

從圖6可以看出，不同發(fā)酵時(shí)期培養(yǎng)料中吲哚-3-乙酸和赤霉素的相對峰面積變化趨勢相似，在T5時(shí)期達(dá)到最高值，茉莉酸的相對峰面積隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在T2時(shí)達(dá)到最高值。脫落酸相對峰面積變化趨勢與茉莉酸類似，最大值出現(xiàn)在T4。

3 討論與結(jié)論

筆者在本研究中采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對不同發(fā)酵時(shí)期的平菇培養(yǎng)料中的代謝物進(jìn)行分析，差異代謝物總數(shù)最多的是T2 vs T1，其次是T3 vs T2，最少的是T5 vs T4。這與筆者前期對5個(gè)發(fā)酵時(shí)期培養(yǎng)料中微生物的代謝功能差異的分析結(jié)果基本一致[3]。發(fā)酵培養(yǎng)料中的漆酶、木聚糖酶和蛋白酶活性峰值出現(xiàn)在發(fā)酵降溫階段[3]，表明木質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)的分解主要是在發(fā)酵后期發(fā)生，因此T2 vs T1和T3 vs T2時(shí)糖類及其衍生物和氨基酸、肽類及其類似物相對含量顯著下降。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期（T2和T3）微生物代謝旺盛，需要大量的糖類和氨基酸以滿足其生長和繁殖所需，導(dǎo)致T2和T3時(shí)發(fā)酵料中的糖類和氨基酸含量均較發(fā)酵前一時(shí)期（T1和T2）有所下降;到發(fā)酵后期（T4和T5），木質(zhì)纖維素降解酶和蛋白酶活性大幅升高，大量木質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)被降解生成低分子糖、肽類和氨基酸，因而其含量均比發(fā)酵前一時(shí)期（T3和T4）有所增加。發(fā)酵料中的Actinobacteria、Thermus和Bacillus屬的微生物具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力[18]。發(fā)酵料中的抑菌物質(zhì)含量隨發(fā)酵進(jìn)程逐漸增加，為后期平菇開放式接種創(chuàng)造了良好的條件。這與筆者前期研究結(jié)果一致，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵料浸提液對青霉和木霉的抑制作用也隨之增強(qiáng)[19]。維生素可以作為輔酶因子參與多種重要的生化反應(yīng)，是生物不可或缺的生長因子。不同微生物之間可能憑借維生素的種間傳遞而建立相互作用關(guān)系，對微生物群落結(jié)構(gòu)形成和功能發(fā)揮起著重要作用[20]。與抑菌物質(zhì)含量變化趨勢相似，發(fā)酵培養(yǎng)料中的維生素含量也較發(fā)酵前一時(shí)期有所增加。在自然界中，木質(zhì)纖維素可以被微生物分解成低分子的芳香族化合物，如水楊酸、阿魏酸等[21-22]。與T1相比，T2時(shí)期發(fā)酵培養(yǎng)料中的苯丙素類和聚酮類物質(zhì)相對含量明顯下降，這可能是因?yàn)槲⑸飪?yōu)先利用易降解的低分子物質(zhì)，而T3、T4和T5時(shí)的苯丙素類和聚酮類物質(zhì)相對含量分別比發(fā)酵前一時(shí)期有所增加，隨著發(fā)酵的繼續(xù)，玉米芯中易于降解的物質(zhì)被利用完，微生物開始降解復(fù)雜高分子物質(zhì)如木質(zhì)素和酚類物質(zhì)，進(jìn)而生成了較多的低分子苯丙素類和聚酮類物質(zhì)。研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑如吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸可以促進(jìn)平菇菌絲的生長[23-24]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，T5時(shí)期發(fā)酵培養(yǎng)料浸提液對平菇菌絲生長促進(jìn)作用最為明顯，尤其是體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，平菇菌絲生長速度和生物量分別比對照增加0.53 cm·d-1和0.179 g[25]。這可能與發(fā)酵培養(yǎng)料中的植物生長調(diào)節(jié)劑如脫落酸、吲哚-3-乙酸和赤霉素的相對含量均在發(fā)酵后期達(dá)到最高值有關(guān)。

綜上所述，不同發(fā)酵時(shí)期的玉米芯培養(yǎng)料中的微生物代謝產(chǎn)物具有明顯的差異，并且其中含有豐富的抑菌物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑。該研究為平菇栽培獲得穩(wěn)定的發(fā)酵料質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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