馬二磊　黃蕓萍　臧全宇　郝芳敏　丁偉紅　王毓洪　高海東　劉磊

摘 要： 為了探究微生物菌劑對土壤真菌群落及成員的影響，利用4種微生物菌劑（A.谷樂豐聚谷氨酸微生物菌劑，B.啟高系列生物菌劑，C.施特葆系列菌劑，D.新型菌劑NBmelon）對土壤進行處理，樣品經DNA抽提、PCR擴增和真菌ITS測序，進行分析制圖。結果顯示，處理B和A的Shannon指數、Simpson指數高于CK，處理D、C的Simpson指數高于CK，表明菌劑處理后，土壤真菌群落均勻度得到提高，真菌多樣性優(yōu)于CK。優(yōu)勢種群相對豐度在不同處理間存在差異，處理A、B、D與CK相比分布在不同象限，且圖中距離較遠，表明菌劑處理后土壤樣品的物種構成發(fā)生了變化。處理D（新型菌劑NBmelon）具有降低鐮刀菌屬相對豐度的效果，能減少鐮刀菌屬群落數量，可供后續(xù)開發(fā)利用。因此，施用微生物菌劑具有改變土壤真菌群落結構、提高土壤真菌多樣性、降低有害菌鐮刀菌屬相對豐度、改良土壤的作用。

關鍵詞：甜瓜;微生物菌劑;土壤;真菌群落;連作

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）04-015-06

Abstract： In order to explore the effects of microbial agents on soil fungal community and its members. Four kinds of microbial agents（A. GuLeFeng polyglutamic acid microbial agent， B. QiGao series of microbial agents， C. SuTiBu series of microbial agents， D. New microbial agent NBmelon） were used to treat the soil， and clear water was used as CK. Soil samples were extracted by DNA， amplified by PCR， and sequenced by ITS. Alpha diversity， community composition， PCA and other basic fungal diversity were analyzed and mapped. The results showed thatthe Shannon index and Simpson index of treatment B and A were higher than CK， and the Simpson index of treatment D and C were higher than CK， which indicated that the uniformity of soil fungal community was improved and the fungal diversity was better than CK. The relative abundance of dominant population was different among different treatments. Treatment A， B and D were distributed in different quadrants compared with the control， and the distance in the figure was far， indicating that the species composition of soil samples changed after the treatment. Treatment D （a new fungicide NBmellon） had the good antagonistic effect on reducing the abundance of Fusarium species， which could reduce the number of Fusarium community， and could be used for further development. Therefore， the application of microbial agents can change the community structure of soil fungi， improve the diversity of soil fungi， reduce the abundance of Fusarium species， and improve the soil.

Key words： Melon; Microbial agent; Soil; Fungal community; Continuous cropping

甜瓜是我國重要的園藝經濟作物之一，但受耕地的限制，甜瓜連作現象十分普遍，長期連作導致了土壤微生物菌群失衡，有害病原微生物大量繁殖，病蟲害發(fā)生頻繁，土傳病害逐年加重[1-3]。枯萎病[4-5]、根腐病[6]、果腐病[7-8]是主要的鐮刀菌屬病害，也是重要的土傳病害，一旦發(fā)生往往造成重大損失，連作加重了這些病害的發(fā)生蔓延。近年來，土壤真菌多樣性的研究受到了廣泛的關注。土壤含有豐富的微生物資源，是地球上最復雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一[9]。土壤是地球生態(tài)圈內化學反應最活躍的生態(tài)區(qū)域，是農作物生長發(fā)育的載體，滿足了植物基本的養(yǎng)分供給需求，土壤的質量直接影響農產品的產量與品質。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的組成成分，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用[10]，微生物的多樣性與結構組成是衡量生態(tài)功能的重要指標[11]，可以通過構建土壤微生物組達到土壤健康的目的[12]。微生物菌劑是對植物生長發(fā)育有益的一類生物菌劑，在土壤中形成有利于作物生長的微生物優(yōu)勢菌群，既能提高肥效，達到增產和提質的目的，又能節(jié)約成本、減少環(huán)境污染、提高土壤中的生物多樣性、減輕病害[13]。國內科研人員針對微生物菌劑對土壤真菌群落的影響開展了相關研究，普遍認為可以提高土壤真菌多樣性，減少病害發(fā)生。齊釗等[14]發(fā)現聯(lián)合施用復合微生物菌劑和氨基酸水溶肥，對土壤理化性質和細菌群落結構具有明顯的改善作用。陳文等[15]認為與化肥處理相比， 施用生物有機肥后土壤微生物AWCD 值、Simpson 指數、Mc Intosh指數均提高，土壤微生物活性、多樣性和均一度提高。馬慧媛等[16]認為微生物菌劑能夠提高土壤微生物的Shannon指數、降低Simpson指數，具有改善土壤營養(yǎng)狀況、增加土壤可培養(yǎng)微生物數量、提高土壤微生物多樣性的作用。張春怡等[17]認為土壤消毒并配施枯草芽孢桿菌可以增加土壤毛殼菌、被孢酶屬等有益菌相對豐度，降低鐮刀菌屬、馬杜拉分枝菌屬等有害菌相對豐度。胡可等[18]發(fā)現菌劑與緩釋肥配施不但可以提高土壤微生物功能多樣性，而且還可以提高土壤微生物群落均勻度，從而促進土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，提高土壤微生物群落的生態(tài)功能。但微生物菌劑對多年連作甜瓜土壤真菌群落的影響研究尚未見報道。筆者通過探究微生物菌劑對土壤真菌群落分布的影響，旨在全面了解本地區(qū)土壤真菌群落的組成和結構，探明不同微生物菌劑的施用效果，為指導微生物菌劑的田間使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020年4月9日至5月19日在寧波市東錢湖旅游度假區(qū)高錢村高新農業(yè)技術實驗園區(qū)玻璃溫室進行，選擇多年種植甜瓜連作嚴重連棟玻璃溫室地塊，采用九點取樣法取20～30 cm耕層土壤，將土壤混勻敲碎后過篩去除大顆粒土壤，取8 kg土壤放置于花盆中。

1.2 試驗設置

試驗設置5個處理，A：谷樂豐聚谷氨酸微生物菌劑，B：啟高系列生物菌劑，C：施特葆系列菌劑，D：本實驗室篩選新型菌劑NBmelon，CK：清水對照。每個處理按照廠家推薦濃度連續(xù)使用3次，具體成分和使用方法見表1。采用隨機區(qū)組設計，每個處理3次重復，每10 d處理1次，共處理3次。每次澆灌微生物菌劑1 L，最后1次處理20 d后取土樣進行檢測。

1.3 高通量測序

土壤樣品送南京集思慧遠生物科技有限公司，對土壤真菌進行DNA抽提、PCR擴增和真菌ITS測序，設計ITS 1區(qū)特定引物擴增特異區(qū)域，得到310 bp左右擴增片段。加接頭，測序得到2X250 bp的paired-end數據，通過拼接，可以得到較長序列，從而進行ITS分析。采用Magen Hipure Soil DNA Kit土壤DNA小量提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司生產）進行DNA提取，真菌ITS測序使用ITS1F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）和ITS1R（5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）引物對ITS 1區(qū)進行PCR擴增。采用Illumina公司的NovaSeq 平臺對樣品進行高通量測序，并進行Alpha多樣性、群落構成、PCA等基礎真菌多樣性分析和制圖。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用DPS 16.05進行統(tǒng)計分析，采用Tukey法進行多重比較，并利用Excel 2013進行相關參數的計算和制圖。

2 結果與分析

2.1 真菌群落Alpha多樣性

多年連作甜瓜土壤真菌群落Alpha多樣性如表2所示。多重比較顯示，5個處理的Chao1指數、observed species指數、Shannon指數、Simpson指數、PD_whole_tree 指數、goods_Coverage指數差異不顯著。真菌群落的覆蓋率為99.95%～99.97%，表明所建立的文庫能夠比較真實、有效地反映樣本環(huán)境真菌的多樣性，具有研究意義和實用價值。Chao1指數和observed species指數反映樣品中群落的豐富度，即簡單指群落中物種的數量，而不考慮群落中每個物種的豐度。在5個處理中，CK的Chao1指數和observed species指數最大，分別為309.41和280.00，表明在使用微生物菌劑后，土壤真菌群落物種的數量呈下降趨勢。Shannon指數和Simpson指數反映樣品群落的多樣性，綜合衡量樣品的物種豐富度和均勻度。處理B和A的Shannon指數高于CK（2.44），分別為2.91和2.83，表明處理B和A的真菌多樣性高于CK;處理A、D、B、C的Simpson指數高于CK（0.56），分別為0.63、0.63、0.61、0.59，表明處理A、D、B、C的真菌多樣性高于CK。PD_whole_tree 指數反映樣品群落中的種、屬數，處理B的PD_whole_tree 指數高于對照CK，表明處理B的真菌多樣性高于CK。施用微生物菌劑可以降低土壤真菌群落的物種數量，提高真菌群落的多樣性。

2.2 物種分類構成及豐度分析

對土壤樣品物種分類構成及豐度進行分析并作圖。在綱水平上的土壤真菌群落結構組成表明（圖1），排前十的優(yōu)勢菌綱分別為：Sordariomycetes（糞殼菌綱）、Pezizomycetes（盤菌綱）、Eurotiomycetes（散囊菌綱）、Agaricomycetes（傘菌綱）、Geminibasidiomycetes（雙擔菌綱）、Leotiomycetes（錘舌菌綱）、Lecanoromycetes（茶漬綱）、Dothideomycetes（座囊菌綱）、Mortierellomycetes（被孢霉綱）、Saccharomycetes（酵母綱），其5個處理的平均相對豐度分別為61.75%、18.43%、8.89%、1.81%、0.67%、0.45%、0.29%、0.23%、0.08%、0.03%。Pezizomycetes（盤菌綱）相對豐度在處理A、C、D中增加，Eurotiomycetes（散囊菌綱）和Agaricomycetes（傘菌綱）相對豐度在處理A和B中增加，Geminibasidiomycetes（雙擔菌綱）和Leotiomycetes（錘舌菌綱）相對豐度在處理B中增加，Dothideomycetes（座囊菌綱）相對豐度在處理A、B、C、D中增加，Mortierellomycetes（被孢霉綱）相對豐度在處理A、B、C中增加，Saccharomycetes（酵母綱）相對豐度在處理A和B中增加。處理B的Eurotiomycetes（散囊菌綱）、Agaricomycetes（傘菌綱）、Geminibasidiomycetes（雙擔菌綱）、Leotiomycetes（錘舌菌綱）相對豐度最高分別為18.32%、3.97%、1.29%、0.68%，處理C的Pezizomycetes（盤菌綱）相對豐度最高為28.05%，CK的Sordariomycetes（糞殼菌綱）相對豐度最高為73.17%。

在屬水平上的土壤真菌群落結構組成表明（圖2），排前十的優(yōu)勢菌屬分別為：Morchella（羊肚菌屬）、Penicillium（青霉菌屬）、Aspergillus（曲霉菌屬）、Scedosporium（絲飽菌屬）、Chrysosporium（金孢子菌屬）、Geminibasidium（雙擔菌屬）、Fusarium（鐮刀菌屬）、Chaetomium（毛殼菌屬）、Bjerkandera（煙管菌屬）、Acremonium（支頂孢屬），其5個處理的平均相對豐度分別為43.76%、5.78%、5.01%、4.93%、4.07%、2.60%、1.53%、0.83%、0.44%、0.27%。Morchella（羊肚菌屬）相對豐度在處理C和D中增加，Aspergillus（曲霉菌屬）相對豐度在處理A、B、D中增加，Scedosporium（絲飽菌屬）、Acremonium（支頂孢屬）相對豐度在處理A中增加，Geminibasidium（雙擔菌屬）、Bjerkandera（煙管菌屬）相對豐度在處理B中增加，Fusarium（鐮刀菌屬）相對豐度在處理C中增加。處理A的Scedosporium（絲飽菌屬）相對豐度最高為9.25%，處理B的Aspergillus（曲霉菌屬）、Geminibasidium（雙擔菌屬）、Bjerkandera（煙管菌屬）相對豐度最高分別為7.67%、4.40%、2.17%，處理C的Morchella（羊肚菌屬）、Fusarium（鐮刀菌屬）相對豐度最高分別為62.87%、3.69%，CK的Penicillium（青霉菌屬）、Chrysosporium（金孢子菌屬）、Chaetomium（毛殼菌屬）、Acremonium（支頂孢屬）相對豐度最高分別為11.25%、5.13%、1.24%、0.90%。

2.3 PCA主成分分析

利用PCA主成分分析對各處理OTU組成進行分析并作圖（圖3）。通過分析不同樣本OTU組成可以反映樣本間的差異和距離，樣本在圖中的距離越遠，其組成差異越大。由圖3可知，PC1的貢獻率為27.01%，PC2的貢獻率為25.07%。處理A分布在第1象限，處理B分布在第4象限，處理D分布在第2象限，處理C和CK分布在第3象限。處理A、B、D與CK分布在不同象限，且圖中距離較遠，表明其物種組成與CK存在差異。

2.4 鐮刀菌屬相對豐度

鐮刀菌屬包含很多對甜瓜具有致病力的病原菌，探究鐮刀菌屬相對豐度的變化情況可以評估不同菌劑的處理效果。對不同處理的鐮刀菌屬相對豐度進行作圖（圖4）可知，不同的微生物菌劑處理對鐮刀菌屬相對豐度的影響不一樣。與CK相比，處理D和A的鐮刀菌屬相對豐度分別為0.42%和1.81%，分別比CK低0.14%和1.53%，其中處理D的鐮刀菌屬相對豐度最低;處理C和B的鐮刀菌屬相對豐度高于CK，分別為4.32%和1.92%，其中處理C的鐮刀菌屬相對豐度最高。表明處理D具有降低鐮刀菌屬相對豐度的效果，能減少鐮刀菌屬群落數量;處理A對鐮刀菌屬有一定的抑制效果，但較為有限。

3 討論與結論

在土壤真菌群落Alpha多樣性分析中，CK的Chao1指數和observed species指數最大，分別為309.41和280.00，表明在使用微生物菌劑后，土壤真菌群落物種的數量呈下降趨勢。處理B和A的Shannon指數、Simpson指數高于CK，處理D、C的Simpson指數高于CK，表明菌劑處理后，土壤真菌群落均勻度得到提高，真菌多樣性優(yōu)于CK，其中處理B和A的效果最為明顯。綜合比較發(fā)現，施用微生物菌劑可以降低土壤真菌群落物種數量，真菌豐富度有所降低，但可以提高土壤真菌群落物種的均勻度，真菌多樣性優(yōu)于未施用微生物菌劑的CK。這與胡可等[18]的研究結果一致。

在土壤樣品物種分類構成及豐度分析中，優(yōu)勢種群相對豐度在不同處理間存在差異。在綱水平上的土壤真菌群落結構組成表明，排前十的優(yōu)勢菌綱分別為：Sordariomycetes（糞殼菌綱）、Pezizomycetes（盤菌綱）、Eurotiomycetes（散囊菌綱）、Agaricomycetes（傘菌綱）、Geminibasidiomycetes（雙擔菌綱）、Leotiomycetes（錘舌菌綱）、Lecanoromycetes（茶漬綱）、Dothideomycetes（座囊菌綱）、Mortierellomycetes（被孢霉綱）、Saccharomycetes（酵母綱）。在屬水平上的土壤真菌群落結構組成表明，排前十的優(yōu)勢菌屬分別為：Morchella（羊肚菌屬）、Penicillium（青霉菌屬）、Aspergillus（曲霉菌屬）、Scedosporium（絲飽菌屬）、Chrysosporium（金孢子菌屬）、Geminibasidium（雙擔菌屬）、Fusarium（鐮刀菌屬）、Chaetomium（毛殼菌屬）、Bjerkandera（煙管菌屬）、Acremonium（支頂孢屬）。在PCA主成分分析中，處理A、B、D與CK相比分布在不同象限，且圖中距離較遠，表明菌劑處理后土壤樣品的物種構成發(fā)生了變化。

在鐮刀菌屬相對豐度分析中，處理D和A的鐮刀菌屬相對豐度低于CK，分別為0.42%和1.81%，其中處理D的鐮刀菌屬相對豐度較CK低1.53%。表明處理D（新型菌劑NBmelon）具有降低鐮刀菌屬相對豐度的效果，能減少鐮刀菌屬群落數量，在一定程度上有利于減少枯萎病、根腐病、果腐病等鐮刀菌屬病害的發(fā)生。

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