朱 曄，溫黎明，李 任，畢文娟，于津建，戚孟春

骨質(zhì)疏松癥是中老年人常見的疾病之一，表現(xiàn)為骨吸收過度、骨量減少等對骨相關(guān)疾病治療產(chǎn)生負(fù)面影響的癥狀。許多藥物被用于治療骨質(zhì)疏松，其中金屬元素鍶(strontium，Sr)顯示出較好的效果。作為人體必需元素之一，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、Ⅰ型膠原(Collagen I, Col-1)合成和礦化；也可以通過多種機制或通道抑制破骨細(xì)胞生成，達(dá)到抑制骨吸收的效果。淫羊藿苷(icariin，ICA)是一種調(diào)節(jié)骨代謝的有效中藥提取成分，近年來也被嘗試用于治療骨質(zhì)疏松。Sr和ICA均對骨質(zhì)疏松癥有良好的防治作用，并被嘗試用于促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨的研究中，但二者聯(lián)合應(yīng)用是否具有更好的促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨的效果，尚需進(jìn)一步證實。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鍶標(biāo)準(zhǔn)液購自上海麥克林生物科技公司；淫羊藿苷(純度95%)購自日本TCI公司；MC3T3-E1細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；BCA 蛋白定量檢測試劑盒與鬼筆環(huán)肽染色劑購自上海碧云天生物科技公司; CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所; 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；茜素紅S染液購自上海麥克林生物科技公司。

1.2 實驗分組

根據(jù)本課題組之前研究，單獨摻Sr濃度為80～800 mg/L、單獨摻ICA濃度為0.21～21 mg/L，可表現(xiàn)良好的促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖效應(yīng)，故本實驗選用Sr的濃度分別為80、27和800 mg/L，ICA濃度分別為7×10、7×10和7 mg/L，并進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，以探究促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨作用的最佳濃度配比。根據(jù)藥物濃度不同，分為以下10組：空白組，不加Sr和ICA；S1I1、S1I2、S1I3組，Sr的濃度均為80 mg/L，而ICA濃度分別為7×10、7×10和7 mg/L；S2I1、S2I2、S2I3組，Sr的濃度均為27 mg/L，而ICA濃度分別為7×10、7×10和7 mg/L；S3I1、S3I2、S3I3組，Sr的濃度均為800 mg/L，而 ICA濃度分別為7×10、7×10和7 mg/L。

1.3 方法

1.3.1

熒光顯微鏡觀察 將MC3T3-E1細(xì)胞按1×10/孔濃度接種于96孔板內(nèi)，每組3個復(fù)孔；按細(xì)胞分組加入不同濃度的藥物，于第1、4、7天和11 d每孔加入200 μl的4%的多聚甲醛溶液固定1 h后使用PBS漂洗，再于每孔中加入200 μl的0.5%的Triton-X，靜置20 min后漂洗，再于每孔加入500 μl鬼筆環(huán)肽染色劑，避光條件下靜置1 h后，每孔加入500 μm的DAPI染色劑，避光條件下靜置5 min，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，每孔隨機選取1個視野進(jìn)行圖像采集，對細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行定量評價。

1.3.2

MC3T3-E1細(xì)胞增殖CCK-8法檢測 將密度為1×10/孔濃度的MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組3個復(fù)孔。各組加藥并于第1、4、7天和11 d使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖能力。按照試劑盒說明書加入CCK-8試劑后，于37 ℃環(huán)境下避光孵育4 h；然后將每孔的待測液吸取100 μl，并轉(zhuǎn)移至新孔板，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.3

細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性檢測 MC3T3-E1細(xì)胞按1×10/孔濃度接種于96孔板內(nèi)，每組3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基為含2%胎牛血清和成骨誘導(dǎo)液的DMEM完全培養(yǎng)基并加藥，于培養(yǎng)第4和7天檢測各組細(xì)胞ALP活性。各組樣品細(xì)胞的ALP活性采用ALP測定試劑盒檢測，使用酶標(biāo)儀檢測520 nm波長下的吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4

茜素紅S染色 在每個Sr濃度(S1、S2、S3)的3組細(xì)胞中(不同ICA濃度)，選取細(xì)胞增殖活性和ALP活性相對較高的S1I2、S2I2和S3I3組，與空白組一起，將細(xì)胞按1×10/孔濃度接種于6孔板內(nèi)，每組3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基為含2%胎牛血清和成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d后，使用配置好的茜素紅S染液進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色，自然光下拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 MC3T3-E1細(xì)胞增殖的熒光顯微鏡觀察

MC3T3-E1細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察見圖1。細(xì)胞數(shù)量定量分析顯示(表1)，在4、7和11 d時，S1I2組細(xì)胞數(shù)量最多，與其他各組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.01)，S3I1、S3I2和S3I3組次之，而空白組除第1天外，在第4、7、11天細(xì)胞數(shù)量均最少，與其他各組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。

2.2 CCK8檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性

CCK-8檢測MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性結(jié)果見表2。 1、4、7和11 d時， S1I2組吸光度值最高，空白組吸光度值最低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。上述結(jié)果與細(xì)胞增殖的熒光顯微鏡觀察結(jié)果基本一致。

2.3 MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性檢測

MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性檢測由表3所示。4和7 d時，S1I2組吸光度值最高，其次是S3I3組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，其余組再次之，空白組吸光度值最低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。

表1 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞增殖數(shù)量分析

表2 MC3T3-E1細(xì)胞增殖CCK8檢測分析

表3 ALP活性分析

2.4 茜素紅S染色

MC3T3-E1細(xì)胞的茜素紅S染色由圖2所示。各組均可見紅染顆粒，S1I2組紅染顆粒最多，且整體顏色更深，說明礦化顆粒形成較多，S3I3組次之，S2I2組再次之，空白組紅染顆粒最少。

圖1 MC3T3-E1細(xì)胞增殖的熒光顯微鏡觀察 ×40

圖2 茜素紅S染色在自然光下觀察A：空白組；B：S1I2組；C：S2I2組；D：S3I3組

3 討論

目前，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要通過增加骨形成、抑制骨吸收等改善骨質(zhì)疏松。同時促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重作用也是Sr和ICA抗骨質(zhì)疏松的核心優(yōu)勢。在Sr促成骨研究中，Julien et al報道Sr2+釋放濃度大致在0.87～8.76 ppm時可具有較好的促成骨活性，然而Meunier et al發(fā)現(xiàn)，25和150 mg/(kg·d)的雷奈酸鍶不能促進(jìn)去卵巢大鼠成骨。在ICA促進(jìn)成骨的研究中，F(xiàn)eng et al報道，3.5 g/L濃度的ICA可誘導(dǎo)骨保護(hù)素敲除小鼠的顱骨表面骨形成；然而Zhang et al報道骨保護(hù)素敲除小鼠灌胃ICA(0.3 g/kg)8周后，導(dǎo)致小鼠骨生成減弱。雖然以上研究的給藥方案的不同，因而不同研究所采用的劑量是不可比擬的，但仍可從中推測Sr與ICA可能在一定范圍內(nèi)才能夠具有促進(jìn)成骨的效果。

有研究表明鍶鹽聯(lián)合ICA對MSCs分化的效果要好于單一用藥的效果，其機制可能是鍶鹽和ICA均可通過激活 Wnt信號，并促進(jìn)成骨因子Runx-2的表達(dá)，抑制成脂因子PPAR-γ2的表達(dá)，所以會產(chǎn)生協(xié)同作用，致使兩者聯(lián)合應(yīng)用的效果更佳。提示在一定濃度范圍配比下聯(lián)合應(yīng)用這2種藥，可能在不增加藥物副作用的前提下一定程度上增加促成骨作用的效果。

本研究通過檢測兩者聯(lián)合應(yīng)用對成骨細(xì)胞的增殖、ALP活性及茜素紅S染色的影響，探究Sr與ICA聯(lián)合應(yīng)用時能夠促進(jìn)成骨的最佳濃度。成骨細(xì)胞是參與骨生成的重要功能性細(xì)胞，其細(xì)胞增殖狀態(tài)好壞是影響骨生成的重要條件。熒光染色法可以直觀的觀察前成骨細(xì)胞數(shù)量及生長情況，實驗中各組的細(xì)胞數(shù)量及在早期的細(xì)胞形態(tài)均要優(yōu)于空白組，說明在實驗組所采用的用藥濃度下，Sr與ICA聯(lián)合應(yīng)用有利于MC3T3-E1細(xì)胞的增殖。CCK-8法檢測結(jié)果也同樣印證了S1I2組濃度下促MC3T3-E1細(xì)胞增殖效果最好，提示Sr與ICA在此濃度范圍內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)前成骨細(xì)胞的增殖的效果更佳。

ALP活性的高低可反映出成骨定向分化能力和細(xì)胞促礦化能力。本研究中各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理及骨向誘導(dǎo)后，ALP活性檢測結(jié)果顯示，S1I2組ALP活性最高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Sr與ICA聯(lián)合應(yīng)用可有效提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞ALP活性。為了分析Sr與ICA對細(xì)胞骨向分化的影響，茜素紅S染色結(jié)果顯示S1I2組促成骨效果最好，沉積的鈣化顆粒最多，說明兩種藥物在該濃度Sr(80 mg/L )和ICA(7×10mg/L)下促進(jìn)前成骨細(xì)胞骨向分化的效果最佳，此濃度下聯(lián)合用藥可能有助于促進(jìn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的成骨細(xì)胞的骨向分化。

綜上所述，Sr與ICA聯(lián)合應(yīng)用對前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和成骨均有統(tǒng)計學(xué)意義的促進(jìn)作用；且Sr在80 mg/L和ICA在7×10mg/L濃度聯(lián)合應(yīng)用時對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和成骨的促進(jìn)作用最佳。Sr和ICA是否通過相同信號通路或通過其他信號通路起到促成骨的效果，以及其相關(guān)機制在后期尚待進(jìn)一步研究證實。