劉旭琳，張瀟月，田 欣，陳俊良,2，何 蕓,2

牙拔除術(shù)后牙槽骨因缺乏牙齒的支持和功能性刺激會發(fā)生骨吸收，從而給后續(xù)修復(fù)治療帶來不利影響，尤其是對剩余牙槽骨骨質(zhì)和骨量要求頗高的骨支持式修復(fù)方式—種植修復(fù)。研究表明70%～80%骨吸收發(fā)生在拔牙后的最初3個月，且水平向骨喪失量多于垂直向。如果能在拔牙同時采取措施，有效促進(jìn)成骨，能對牙槽嵴形態(tài)的維持起到重要作用。雖然，很多學(xué)者嘗試將生物材料局部應(yīng)用于拔牙窩，期望能促進(jìn)成骨；但是目前尚沒有公認(rèn)理想的生物材料。前期研究顯示將由地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組成的成骨誘導(dǎo)劑(osteogenic inducer，OI)局部應(yīng)用于兔拔牙窩，影像學(xué)和組織學(xué)分析顯示OI可促進(jìn)拔牙創(chuàng)周圍早期骨改建，減少牙槽骨高度的吸收。但同時也發(fā)現(xiàn)一個問題：牙槽骨寬度(alveolar bone width, ABW)吸收與對照相比無明顯差異。由此推測，這可能與藥物不均勻釋放以及局部藥物濃度難以長期維持有關(guān)。因此，該研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)為緩釋載體，OI為有效藥物成分，研制出了黏度適宜，凝結(jié)良好，能夠緩慢、穩(wěn)定釋放藥物的OI緩釋系統(tǒng)。且已通過體外實驗, 證實了其對成骨細(xì)胞增殖、分化的的促進(jìn)作用。該研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行動物水平的體內(nèi)研究，將OI緩釋系統(tǒng)局部應(yīng)用于兔下前牙拔牙窩，觀察其對拔牙創(chuàng)骨改建的影響，為臨床上尋求一種操作方便、價格合理、釋放可控的生物材料以促進(jìn)拔牙創(chuàng)骨改建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡雄性新西蘭大白兔27只,體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，所有動物均獨立籠養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，自由進(jìn)食，觀察2周后用于實驗。動物實驗程序按照赫爾辛基倫理標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，并獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:20160034)。

1.2 實驗材料

OI成分：β-甘油磷酸鈉(美國Sigma公司)、維生素C、地塞米松(北京索萊寶科技有限公司)；PLGA 75/25(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，有機溶劑N-甲基-2吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)、反應(yīng)性增溶劑三乙酸甘油酯(Glycerol triacetate , GTA)，上海麥克林生物科技有限公司。NMP與GTA體積比為5 ∶5，PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，OI體積分?jǐn)?shù)為15%。

1.3 儀器設(shè)備

正置相差顯微鏡BX50(日本Olympus公司)，旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機RM2235(德國Leica公司),KODAK 9500錐形束CT(cone beam CT, CBCT) ( 美國Care stream Health公司)，Mimics Research軟件(比利時Materialise公司)，Image-Pro Plus圖像分析軟件(美國Media Cybernetic公司)。

1.4 實驗方法

將27只新西蘭大白兔隨機分為PLGA+OI組、PLGA組和空白組，每組各9只。用3%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射對實驗兔進(jìn)行全身麻醉，麻醉劑量30 mg/kg。角膜反射消失后取仰臥位固定于手術(shù)臺，手術(shù)區(qū)消毒，碘伏消毒口腔，牙周探針分離牙齦，微創(chuàng)拔牙挺配合牙鉗微創(chuàng)拔除雙側(cè)下頜前牙，搔刮沖洗牙槽窩，清除殘余骨屑等。PLGA+OI組拔牙創(chuàng)內(nèi)注入OI緩釋系統(tǒng)1.0 ml，使其填塞整個拔牙窩(圖1)；PLGA組注入空載PLGA凝膠1.0 ml；空白組不作處理，用可吸收線拉攏縫合牙齦。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素(每天3次，每次80萬單位)。術(shù)后1周，喂流質(zhì)食物，每周調(diào)磨上頜前牙，避免其過度生長而導(dǎo)致咬合創(chuàng)傷。密切觀察傷口愈合情況及實驗兔的精神和活動情況。分別于術(shù)后2、4、8周時，每組隨機處死3只實驗動物，取下前牙區(qū)牙槽骨標(biāo)本，拍攝CBCT后立即用10%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，制作組織切片備用。

圖1 微創(chuàng)拔除新西蘭大白兔雙側(cè)下前牙

1.5 影像學(xué)檢查

CBCT拍攝參數(shù)：5.0 mA ，120 kV曝光9.6秒,層厚0.2 mm。每張CBCT均選擇3個切面進(jìn)行測量，每個切面隨機測3次。骨密度值(bone mineral density, BMD)用Mimics Research軟件的密度測量工具進(jìn)行測量，測量位置為高于下頜骨下緣 4、6、8 mm的3 個水平切面，切面厚度1 mm，每個切面隨機選擇拔牙窩內(nèi)5 mm 周徑的矩形區(qū)域進(jìn)行分析(圖2)，以測量的平均CT值記錄為該樣本的密度。ABW和牙槽骨高度(alveolar bone height, ABH)變化值以8周組動物的拔牙前CBCT測量值(CBCT Ⅰ)減去處死后CBCT測量值(CBCT Ⅱ)表示。寬度的測量位置同BMD，測量各平面上的最大寬度。高度測量在3個矢狀面切面上進(jìn)行，分別是：拔牙窩頰側(cè)切平面，舌側(cè)切平面，以及前2 個平面的中間平面，以下頜骨下緣到牙槽骨頂點的最大值作為高度值(圖3)。

圖2 測量BMD值 A：測量位置； B：測量區(qū)域

圖3 測量ABW和ABH A：ABW測量示意；B：ABH測量位置；C：ABH測量示意

1.6 組織學(xué)檢查

取各組實驗標(biāo)本于多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣2個月，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，做拔牙窩冠狀位切片，切片層厚2～3 μm，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，正置相差顯微鏡觀察新生骨組織情況。每張切片均在×100下進(jìn)行觀察。通過Image-Pro Plus(Media Cybernetic,Silver Springs,MD,USA)圖像分析軟件對標(biāo)本切片進(jìn)行測量，每張切片均選取拔牙創(chuàng)正中位置水平方向連續(xù)3個視野，計算新生骨小梁的面積比。

2 結(jié)果

2.1 骨密度測量結(jié)果

隨著術(shù)后時間的延長，各組骨密度均不斷增加。術(shù)后2、4、8周，PLGA+OI組BMD均大于PLGA組和空白組，PLGA組大于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.001)，見表1。

表1 各組不同時間點BMD測量值

2.2 ABW及ABH測量結(jié)果

術(shù)后8周，ABW及ABH變化值測量結(jié)果見表2，可見各組數(shù)據(jù)均為正數(shù)，說明各組的ABW和ABH均出現(xiàn)了不同程度的吸收。PLGA+OI組寬度與高度變化值均小于PLGA組與空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.001)。

表2 術(shù)后8周各組ABW和ABH變化值

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后2周，PLGA+OI組(A1)可見較多新生骨島，成骨細(xì)胞規(guī)則排列在新生骨組織周圍，PLGA組(B1)和空白組(C1)新生骨較少，可見大量血細(xì)胞及纖維結(jié)締組織。術(shù)后4周，PLGA+OI組(A2)新生骨組織相互連接形成板層狀類骨質(zhì)，骨小梁較粗大，排列整齊，PLGA組(B2)間質(zhì)內(nèi)仍可見大量血細(xì)胞，空白組(C2)纖維結(jié)締組織較多，少量骨組織散在分布。術(shù)后8周，PLGA+OI組(A3)，已形成成熟板狀骨，骨板致密，與周圍骨組織完全融合，PLGA組(B3)新生骨組織排列紊亂，可見破骨性陷窩，空白組(C3)新生骨組織未完全融合(圖4)，定量分析結(jié)果見表3。

表3 各組不同時間新生骨面積百分比

3 討論

拔牙創(chuàng)的骨改建是成骨細(xì)胞主導(dǎo)的新骨形成和破骨性吸收之間的動態(tài)平衡，其中新骨形成起著重要的作用。而拔牙創(chuàng)愈合過程中，上皮細(xì)胞和結(jié)締組織向拔牙創(chuàng)內(nèi)生長速度比骨組織更快，使軟組織優(yōu)先占據(jù)拔牙窩，使骨形成相對減少，從而導(dǎo)致牙槽嵴高度和寬度降低。因此促進(jìn)牙拔除術(shù)后拔牙窩的早期骨改建對牙槽嵴形態(tài)的維持及后續(xù)修復(fù)治療具有重要作用。目前研究較多的局部應(yīng)用藥物及材料有Bio-Oss骨粉、重組人形態(tài)發(fā)生蛋白-2、富血小板纖維蛋白等。但由于這些材料存在價格較貴、遠(yuǎn)期效果尚不確定等缺陷，目前尚沒有公認(rèn)一致的材料可用于拔牙后促進(jìn)牙槽骨改建。理想的骨組織工程支架應(yīng)具備以下特點：具有良好的生物相容性，骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，其降解速率與骨生長速率相匹配，促進(jìn)骨質(zhì)的沉積和生長，其降解產(chǎn)物無毒性，經(jīng)濟(jì)易得等。在前期研究表明局部應(yīng)用由10mmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg維生素C組成的OI，能促進(jìn)新西蘭兔拔牙創(chuàng)骨愈合的基礎(chǔ)上，利用PLGA作為緩釋載體，構(gòu)建OI緩釋系統(tǒng)，通過觀察研究不同溶劑配比、溶劑用量、PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和OI體積分?jǐn)?shù)對凝膠性狀、凝結(jié)時間、凝膠黏度和藥物累積釋放率的影響，發(fā)現(xiàn)溶劑N-甲基-2吡咯烷酮 ∶三乙酸甘油酯體積比為5 ∶5,PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%,OI體積分?jǐn)?shù)為15%的凝膠黏度適宜，凝結(jié)良好，藥物濃度維持時間達(dá)14 d以上。本實驗將以PLGA凝膠為載體的OI緩釋系統(tǒng)局部應(yīng)用于兔下前牙拔牙窩，影像學(xué)結(jié)果提示OI緩釋系統(tǒng)能較快提高新骨骨密度，并減少拔牙創(chuàng)愈合早期ABW和ABH的吸收。組織學(xué)結(jié)果提示PLGA+OI組新生骨組織速度優(yōu)于PLGA組和空白組。

OI緩釋系統(tǒng)促進(jìn)牙拔除術(shù)后早期骨改建，降低ABW及ABH吸收的機制可能與以下幾個因素有關(guān)：PLGA凝膠一方面使OI的釋放均勻緩慢，延長了藥物作用時間；另一方面作為支架結(jié)構(gòu)阻擋上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及軟組織的長入，為成骨細(xì)胞向拔牙窩內(nèi)的增殖分化提供足夠空間。OI緩釋系統(tǒng)藥物成分能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化。其藥物成分的成骨誘導(dǎo)機制與以下幾個因素有關(guān)：① 地塞米松可以顯著增加骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，刺激細(xì)胞外膠原基質(zhì)的合成、鈣的沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成。同時，地塞米松能刺激骨改建重要核心因子的表達(dá)并增強其的活性，使成骨標(biāo)志基因(骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白等)的轉(zhuǎn)錄增加，從而刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并激活成骨細(xì)胞功能。② β-甘油磷酸鈉則可以為成骨細(xì)胞提供磷酸離子，促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣化，從而加速節(jié)結(jié)鈣化。③ 維生素C可以調(diào)節(jié)堿性磷酸酶的活性，啟動鈣化; 同時，能促進(jìn)細(xì)胞合成膠原，形成鈣化，促進(jìn)成骨。

圖4 HE染色結(jié)果 ×100 A：PLGA+OI組；B：PLGA組；C：空白組;1、2、3：隨機選取不同位置

綜上所述，以PLGA凝膠為載體的OI緩釋系統(tǒng)可有效延長OI作用時間，促進(jìn)兔拔牙創(chuàng)早期骨愈合，降低ABW和ABH的吸收值。此生物材料制作簡便，臨床應(yīng)用程序簡便、易于掌握，價格相對便宜，為牙拔除術(shù)后牙槽嵴形態(tài)的維持提供了新方法。