陳俊逸，陳 晶，張 蒙，梁朝朝，陳先國

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)發(fā)病率的70%～80%。手術(shù)是局限性RCC的主要治療方式，而晚期和轉(zhuǎn)移性RCC主要依賴于免疫治療、靶向藥物和化療。該疾病的病死率仍呈逐年上升趨勢。因此，鑒定出新型的生物標(biāo)志物可用于ccRCC患者的復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險預(yù)測，對于患者的術(shù)后治療意義重大。

自噬是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，在自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，ARG)的調(diào)控下，細(xì)胞可通過分解大分子物質(zhì)提供氨基酸及合成新蛋白的其他必需因子。已有大量研究支持自噬與ccRCC的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。然而，關(guān)于ARGs是否可用于ccRCC患者術(shù)后預(yù)后評估尚未明確。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料

從TCGA中下載ccRCC患者的ARGs表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，包括537例ccRCC腫瘤和96例非腫瘤組織的RNA測序數(shù)據(jù)，其中包括489例有配對臨床資料的ccRCC樣本。提取的臨床數(shù)據(jù)信息包括總生存期(overall survival，OS)、年齡、性別、腫瘤分級、T分期、病理分級。所有數(shù)據(jù)下載于2020年4月12日。

1.2 方法

應(yīng)用R統(tǒng)計軟件中的“EdgeR”軟件包對下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行提取分析，篩選出ccRCC和非腫瘤組織間的差異表達(dá)自噬相關(guān)基因(differentially expressed autophagy-related genes，DEARGs)(篩選條件為log FoldChange≥2或≤-2，F(xiàn)DR

P

<0.05)。然后，對DEARGs采用單因素Cox回歸分析，依據(jù)

P

<0.05篩選出與患者OS相關(guān)的DEARGs。接下來，將篩選出的與預(yù)后相關(guān)的DEARGs納入多因素Cox回歸分析中并建立預(yù)后風(fēng)險評分RS(risk score，RS)模型，計算每位患者的RS，依據(jù)評分中位值將患者分為高、低風(fēng)險組，利用卡普蘭一梅爾估計量(Kaplan-Meier，K-M)法對比組間預(yù)后的差異，并計算受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評價模型的有效性，并計算曲線下面積(area under curve，AUC)。最后通過多因素Cox回歸分析探討該RS是否獨立于各項臨床病理參數(shù)(年齡、性別、腫瘤分級、T分期、病理分級)，作為ccRCC患者獨立預(yù)后因子。

2 結(jié)果

2.1 篩選

DEARGs

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取了537例ccRCC腫瘤和96例非腫瘤組織的RNA測序數(shù)據(jù)，提取了215個ARGs的表達(dá)譜。利用“EdgeR”軟件對比了癌和非癌組織，以logFoldChange≥2或≤-2和FDR

P

<0.05為截斷標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出了36個上調(diào)和9個下調(diào)的ARGs。圖1A散點圖顯示了9個下調(diào)基因(

FAM215A

、

DIRAS3

、

PRKCQ

、

GABARAPL1

、

ERBB2

、

BAG1

、

HIF1A

、

TP63

和

MTOR

)和36個上調(diào)基因(

CX3CL1

、

ATG12

、

BID

、

IL24

、

RACK1

、

FAS

、

BAX

、

CASP4

、

VMP1

、

CCR2

、

P4HB

、

GAPDH

、

ERO1A

、

GRID1

、

EGFR

、

MYC

、

BNIP3

、

SERPINA1

、

SPHK1

、

RAB24

、

RGS19

、

CASP1

、

NLRC4

、

NRG3

、

APOL1

、

EIF4EBP1

、

HSPB8

、

ATG16L2

、

BIRC5

、

CXCR4

、

ATG9B

、

TP73

、

NKX23

、

VEGFA

、

IFNG

和

CDKN2A

)。圖1B熱圖顯示DEARGs表達(dá)水平的層次聚類。

圖1 ccRCC組織與正常組織之間DEARGs

2.2 基于DEARGs的預(yù)后模型的建立

將有配對臨床資料的489例ccRCC樣本(表1)，通過隨機(jī)抽樣的方法按照7 ∶3的拆分為訓(xùn)練組(n=344)與驗證組(

n

=145)，訓(xùn)練組用于建模，驗證組用于外部驗證預(yù)后模型的效能。通過對這45個DEARGs的單因素Cox回歸分析后，得到了21個與OS有關(guān)的DEARGs(圖2)，納入多因素Cox回歸分析，篩選出8個DEARGs用于模型的構(gòu)建(

BID

、

EIF4EBP1

、

ATG16L2

、

CX3CL1

、

IFNG

、

PRKCQ

、

EIF4EBP

、

VMP1

)。其中，

ATG16L2

，

RAB24

，

EIF4EBP1

，

IFNG

和

BID

為高風(fēng)險基因，而

VMP1

，

PRKCQ

和

CX3CL1

為保護(hù)基因。各基因的風(fēng)險系數(shù)(coefficient，COEF)及風(fēng)險比(hazard ratio，HR)見表2。COEF×風(fēng)險基因表達(dá)值為RS的因變量，得到OS RS=(0.718×

BID

表達(dá)值)+(0.281×

EIF4EBP1

表達(dá)值)+(0.326×

ATG16L2

的表達(dá)值

)+(-0.220×CX3CL1

表達(dá)值)+(0.280×

IFNG

表達(dá)值)+(-0.299×

PRKCQ

表達(dá)值)+(0.281×

EIF4EBP1

表達(dá)值)+(-0.233×

VMP1

表達(dá)值)。

2.3 預(yù)測模型的有效性和穩(wěn)定性評估

訓(xùn)練組中位RS為0.95，將評分<0.95的172例患者納入低風(fēng)險組，評分≥0.95的172例患者納入高風(fēng)險組。訓(xùn)練組中ccRCC患者的RS評分、生存分布和ARGs表達(dá)見圖3，本研究發(fā)現(xiàn)隨著RS值的升高，患者生存時間呈縮短趨勢，且死亡患者人數(shù)明顯增加(圖中紅點顯示)。熱圖中高RS患者顯示

VMP1

、

ATG16L2

、

RAB24

、

BID

和

EIF4EBP1

上調(diào)，而

IFNG

、

CX3CL1

和

PRKCQ

降低，低風(fēng)險患者顯示

IFNG

、

CX3CL1

和

PRKCQ

上調(diào)，

VMP1

、

ATG16L2

、

RAB24

、

BID

和

EIF4EBP1

上調(diào)。進(jìn)一步K-M法結(jié)果顯示，高風(fēng)險組患者的預(yù)后比低風(fēng)險組差(圖4A，

P

<0.05)，且ROC曲線提示該模型具有較高的預(yù)測價值(圖4B，AUC=0.783，95%

CI

=0.723～0.897)。為驗證預(yù)后預(yù)測模型的靈敏度與穩(wěn)定性，對驗證組進(jìn)行了分析。依據(jù)RS評分，將驗證組145例ccRCC患者分為高風(fēng)險(

n

=72)和低風(fēng)險(

n

=73)組，K-M法揭示低風(fēng)險組患者與高風(fēng)險組相比OS延長(

P

<0.05)(圖5)。ROC曲線提示該模型在驗證隊列中仍持有較高的預(yù)測價值(AUC=0.754，95%

CI

=0.706～0.873)，特異度為84.1%。綜上所述，這些結(jié)果提示DEARGs預(yù)測模型能夠有效的預(yù)測ccRCC患者的預(yù)后。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中489例ccRCC患者的臨床特征

表2 DEARGs多因素Cox回歸分析

圖2 單因素Cox回歸中21個與總體生存有關(guān)的ARGs森林圖

圖3 RS分布圖與DEARGs熱圖及生存時間散點圖

圖4 訓(xùn)練組DEAGs模型預(yù)測效果評估

2.4 自噬相關(guān)預(yù)后模型與患者生存期獨立相關(guān)

研究進(jìn)一步利用多因素分析評估了訓(xùn)練組RS與臨床病理參數(shù)(年齡、性別、腫瘤分期、T分期、病理分級之間的關(guān)系。如表3所示，單因素Cox回歸分析表明ccRCC患者的年齡、性別、腫瘤分期、病理分級、RS與OS相關(guān)(

P

<0.05)。多因素Cox回歸分析揭示RS與總體生存相關(guān)，可作為患者OS評估的獨立預(yù)測因子(

P

<0.05)。此外，病理分級也與患者OS相關(guān)(

P

<0.05)，可作為預(yù)后評估獨立因子。這些結(jié)果表明，基于DEARGs的OS預(yù)后預(yù)測模型可有效區(qū)分高危和低危死亡風(fēng)險的ccRCC患者，且可作為預(yù)后評估的獨立預(yù)測因子。

圖5 驗證組DEAGs模型預(yù)測效果評估

表3 單因素和多因素Cox回歸分析影響患者總體生存期的因素

3 討論

有研究表明了多個ARGs與ccRCC發(fā)病或進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)，但尚無系統(tǒng)研究評估ARGs是否可以作為ccRCC患者預(yù)后評估標(biāo)志物。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中ccRCC和正常組織表達(dá)譜與臨床生存資料進(jìn)行統(tǒng)計分析得到基于8個AGEs的多因素RS模型：RS=(0.718×

BID

表達(dá)值)+(0.281×

EIF

4

EBP1

表達(dá)值)+(0.326×

ATG16L2

的表達(dá)值)+(-0.220×

CX3CL1

表達(dá)值)+(0.280×

IFNG

表達(dá)值)+(-0.299×

PRKCQ

表達(dá)值)+(0.281×

EIF

4

EBP1

表達(dá)值)+(-0.233×

VMP1

表達(dá)值)。K-M法、log-rank法和ROC分析在訓(xùn)練組和驗證組中揭示了預(yù)測模型的特異性和穩(wěn)定性。同時，多因素分析揭示該模型為ccRCC患者OS的獨立預(yù)測因素，進(jìn)一步佐證了ARGs與ccRCC的關(guān)聯(lián)。模型共納入8個差異表達(dá)的ARGs。

BID

位于染色體22q11.21上，編碼與凋亡相關(guān)的蛋白，研究顯示其可在甲狀腺癌組織中高表達(dá)，并與患者預(yù)后緊密相關(guān)。

ATG16L2

位于11號染色體上，尚無文獻(xiàn)報道該基因在腫瘤發(fā)生或進(jìn)展中的作用。而在當(dāng)前研究中，顯示

ATG16L2

表達(dá)上調(diào)并與ccRCC患者的OS降低有關(guān)。

EIF4EBP1

在肝細(xì)胞癌和乳腺癌組織中表達(dá)水平升高且與患者預(yù)后不佳有關(guān)。

PRKCQ

在腫瘤中的作用機(jī)制尚未完全闡明，研究表明，

PRKCQ

在包括胃腸道間質(zhì)瘤在內(nèi)的實體腫瘤中均表達(dá)上調(diào)。RAB24目前在功能方面研究較少，Chen et al發(fā)現(xiàn)其在肝細(xì)胞癌中上調(diào)，過表達(dá)該基因可促進(jìn)肝癌細(xì)胞進(jìn)展和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

CX3CL1

基因位于16號染色體，研究表明

CX3CL1

與

CCR1

，

CCL5

受體協(xié)同誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。

VMP1

在肝細(xì)胞癌中，抑制增殖和轉(zhuǎn)移，而在胰腺細(xì)胞系中，對

VMP1

的抑制會降低細(xì)胞凋亡。

IFNG

在腫瘤方面研究較少，Garcia-tunon et al發(fā)現(xiàn)IFNG在乳腺纖維囊性病變、原位和浸潤性腫瘤中的表達(dá)量上調(diào)，提出IFNG可作為乳腺癌的一種前瞻性治療方式。

綜上所述，本研究通過Cox回歸分析組建了由8個DEARGs構(gòu)成的ccRCC患者預(yù)后預(yù)測模型。研究證明了該模型具有較高的特異性與靈敏度，其可補(bǔ)充臨床病理參數(shù)用于術(shù)后患者的預(yù)后評估和治療指導(dǎo)，推進(jìn)了ccRCC患者的個體化醫(yī)療進(jìn)展。