湯祥瑞，張 勇，祝 領(lǐng)，崔倩衛(wèi)，劉仲偉，石 爽

細胞iNOS表達，分泌炎癥因子濃度(

P

均<0.001)、細胞p-STAT1表達水平及STAT1核轉(zhuǎn)位水平(

P

均<0.001)。FPS-ZM1預處理可顯著抑制AGEs誘導的巨噬細胞內(nèi)ROS水平(

P

<0.001)、分泌炎癥因子濃度(

P

均<0.001)、細胞TLR4及p-STAT1表達水平(

P

均<0.001)以及STAT1核轉(zhuǎn)位水平(

P

<0.001)。

結(jié)論

AGEs可通過RAGE/ROS/TLR4/STAT1信號通路誘導巨噬細胞向M1型極化。

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)促進動脈粥樣硬化( atherosclerosis, AS)。M1型巨噬細胞通過參與局部炎癥反應、泡沫細胞生成、血栓形成以及斑塊破裂等過程，促進AS的發(fā)生發(fā)展。由于糖代謝紊亂，T2DM患者體內(nèi)產(chǎn)生大量的晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)，與細胞表面AGEs受體(receptors for AGEs, RAGE)結(jié)合后，通過激活NADPH氧化酶使細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)增加。課題組前期研究表明，糖尿病時細胞內(nèi)ROS水平升高，導致其下游的Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)信號通路激活。信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子1 ( signal transducers and activators of transcription 1, STAT1)是TLR4下游的核因子，激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄誘導巨噬細胞發(fā)生M1型極化。該研究擬對AGEs可通過巨噬細胞ROS/TLR4/STAT1信號通路激活誘導巨噬細胞發(fā)生M1型極化這一科學假說進行驗證，進一步闡明T2DM相關(guān)AS的發(fā)病分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液、D-Hanks培養(yǎng)液及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Hyclone公司；FPS-ZM1購自美國MCE公司，TAK-242購自美國Abmole公司，DCFH-DA活性氧檢測試劑盒購自上海Beyotime公司，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、Alexa Fluor 555熒光標記二抗、DAPI、TLR4抗體、GAPDH抗體、Histone H3抗體以及HRP標記二抗均購自美國Abcam公司；STAT1抗體以及磷酸化STAT1(phosphorylated STAT1, p-STAT1)抗體購自美國CST公司。

1.2 AGEs的制備

AGEs的制備方法及步驟參考本課題組及既往文獻中的描述進行。即在無菌條件下，將牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)與0.1 mmol/L甘油醛在0.2 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH=7.4)中充分混合，37 ℃孵育7 d。使用PD-10脫鹽柱層析法去除未形成基團的糖類。將未與甘油醛混合的BSA作為對照。

1.3 M0型巨噬細胞的分離與培養(yǎng)

原代M0型巨噬細胞的分離與培養(yǎng)步驟均按照既往文獻中的描述進行。C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死后以75%酒精充分消毒，在無菌條件下取出小鼠的股骨及脛骨。去除骨周圍組織，剪去骨兩端，注射器獲取骨髓。1 500 r/min離心8 min后，棄去上清液，以紅細胞裂解液處理。RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞后以40 μm濾網(wǎng)過濾。以含20 ng/ml的M-CSF及20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃條件下進行培養(yǎng)。F4/80染色鑒定獲得的M0型巨噬細胞。上述動物實驗方案經(jīng)陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會批準。

1.4 細胞處理

根據(jù)處理方式不同，將細胞分為以下幾組，分別為：① 對照(control)組；② 低濃度AGEs(L-AGEs)組:以終濃度為2.5 μmol/L的AGEs-BSA培養(yǎng)細胞48 h；③ 中濃度AGEs(M-AGEs)組：以終濃度為5 μmol/L的AGEs培養(yǎng)細胞48 h；④ 高濃度AGEs(H-AGEs)組：以終濃度為10 μmol/L的AGEs培養(yǎng)細胞48 h；⑤ RAGE抑制[RAGE(-)]組：以終濃度為0.25 μmol/L的RAGE阻斷劑FPS-ZM1對巨噬細胞進行2 h預處理后，以終濃度為10 μmol/L的AGEs培養(yǎng)細胞48 h；⑥ TLR4抑制[TLR4(-)]組：以終濃度為0.04 μmol/L的TLR4抑制劑TAK-242對巨噬細胞進行2 h預處理后，以終濃度為10 μmol/L的AGEs培養(yǎng)細胞48 h。

1.5 細胞內(nèi)ROS水平檢測

巨噬細胞內(nèi)ROS水平使用流式細胞術(shù)進行檢測。以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)對各組細胞進行漂洗2遍后，在暗盒中將各組細胞在37 ℃條件下與終濃度為10 μmol/L的2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)共培育30 min。使用FACS流式細胞儀(美國BD公司)在529 nm對DCFH-DA熒光信號進行檢測。

1.6 免疫熒光染色

將各組巨噬細胞制成細胞爬片，PBS漂洗3次后以4%多聚甲醛進行固定。0.2% Triton X-100處理10 min，PBS漂洗3遍后，以封閉緩沖液處理30 min。使用M1巨噬細胞表面標記物iNOS抗體(1 ∶500) 在4 ℃條件下孵育10 h，PBS漂洗后，以Alexa Fluor555標記的IgG第二抗體在37 ℃條件下孵育2 h。DAPI復染。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察并使用image J軟件(ver1.38)對捕捉的熒光圖像進行分析。

1.7 Western blot檢測

離心收集各組巨噬細胞并以胰酶進行消化后，使用配制好的含苯甲基磺酰氟的RIPA蛋白裂解液(上海Beyotime公司)進行處理。4 ℃條件下14 000 r/min離心10 min后，留取上清液并使用總蛋白抽提試劑盒、細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒以及核蛋白提取試劑盒分別對總蛋白、漿蛋白以及核蛋白進行提取。BCA法對蛋白濃度進行檢測，SDS-PAGE對蛋白樣本進行分離后，電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。封閉緩沖液在4 ℃條件下對裁剪的PVDF膜封閉8 h。4 ℃條件下分別使用TLR4抗體、STAT1抗體、p-STAT1、GAPDH抗體以及Histone H3抗體對PVDF膜孵育8 h。TBST漂洗后，室溫下以相應第二抗體孵育30 min，ECL法對Western blot進行顯色，使用image J軟件對捕捉的圖像進行分析。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

收集各組細胞上清液，4 ℃條件下3 000 r/min離心20 min。分別使用白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL -12以及腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNFα) ELISA試劑盒對樣本相應細胞因子水平濃度進行檢測。操作步驟均參照相應ELISA試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 RAGE及TLR4特異性阻斷可抑制AGEs誘導的巨噬細胞M0型向M1型轉(zhuǎn)化

如圖1免疫熒光染色顯示，與control組相比，L-AGEs組iNOS平均熒光強度(mean fluorescent intensity, MFI)較control組顯著升高(

P

<0.001)；M-AGEs組較L-AGEs組顯著升高(

P

<0.001)；H-AGEs組較M-AGEs組顯著升高(

P

<0.001)。TAK-242預處理可使TLR4(-)組iNOS熒光強度顯著下降，較H-AGEs組顯著降低(

P

<0.001)；FPS-ZM1預處理可使RAGE(-)組iNOS熒光強度顯著下降，較H-AGEs組顯著降低[

F

(5,25)=557.9,

P

<0.000 1]。

2.2 RAGE及TLR4特異性阻斷可抑制AGEs誘導的巨噬細胞炎性細胞因子分泌

如圖2所示， L-AGEs組IL-6、TNFα以及IL-12的濃度較control組均顯著升高(

P

<0.001)；M-AGEs組IL-6、TNFα以及IL-12的濃度較L-AGEs組顯著升高(

P

<0.001)；H-AGEs組IL-6、TNFα以及IL-12的濃度較H-AGEs組均顯著升高(

P

<0.001)。TAK-242預處理可使TLR4(-)組的IL-6、TNFα以及IL-12的濃度較H-AGEs組顯著降低(

P

<0.001)；FPS-ZM1預處理可使RAGE(-)組IL-6、TNFα以及IL-12的濃度較H-AGEs均顯著降低[

F

(5,25)=1 445,

P

<0.000 1；

F

(5,25)=80.12,

P

<0.000 1；

F

(5,25)=273,

P

<0.000 1]。

2.3 RAGE特異性阻斷可抑制AGEs誘導的巨噬細胞氧化應激反應

流式細胞術(shù)對DCFH-DA水平進行檢測的結(jié)果如圖3所示。L-AGEs DCFH-DA組平均熒光強度較control組顯著升高(

P

<0.001)；M-AGEs組DCFH-DA MFI較L-AGEs組顯著升高(

P

<0.001)；H-AGEs組DCFH-DA MFI較M-AGEs顯著升高(

P

<0.001)。TAK-242預處理的TLR4(-)組巨噬細胞DCFH-DA MFI較H-AGEs組差異無顯著意義(

P

>0.05)；FPS-ZM1預處理的RAGE(-)組DCFH-DA MFI較H-AGEs組顯著下降(

P

<0.01),[

F

(5,25)=453.2,

P

<0.000 1]。

圖1 免疫熒光檢測細胞iNOS表達

圖2 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液炎癥細胞濃度

圖3 流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS水平

2.4 RAGE及TLR4特異性阻斷可抑制AGEs誘導的巨噬細胞TLR4/STAT1信號通路激

如圖4(A～C)所示，與control組相比，L-AGEs、M-AGEs及H-AGEs組巨噬細胞質(zhì)蛋白TLR4及p-STAT1相對表達水平均升高(

P

<0.001)且具有AGEs的濃度依賴性(

P

<0.001)。FPS-ZM1預處理可使H-AGEs組TLR4及p-STAT1相對表達水平降低(

P

<0.001)；TAK-242預處理可使H-AGEs組p-STAT1相對表達水平降低(

P

<0.001)，而對TLR4相對表達水平差異無顯著意義。如圖4(D、E)所示，與control組相比，L-AGEs、M-AGEs以及H-AGEs組巨噬細胞核蛋白STAT1水平升高(

P

<0.001)，且具有顯著的AGEs的濃度依賴性(

P

<0.001)。TAK-242及FPS-ZM1預處理均可使H-AGEs巨噬細胞核蛋白內(nèi)STAT1相對表達水平降低(

P

<0.001)。[

F

(5,25)=124,

P

<0.0001；

F

(5,25)=188.8,

P

<0.000 1；

F

(5,25)=100.6,

P

<0.000 1]

圖4 Western blot法檢測蛋白水平

3 討論

當T2DM患者持續(xù)高血糖狀態(tài)控制不佳，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類以及核酸相互作用發(fā)生Maillard反應，形成的Schiff堿通過Amadori反應形成具有病理作用的產(chǎn)物AGEs，是T2DM患者體內(nèi)異常代謝產(chǎn)物的典型代表。T2DM患者的主要心血管事件發(fā)生率與其體內(nèi)的AGEs水平有關(guān)。本課題組的前期研究表明，AGEs通過影響不同的細胞參與了AS的發(fā)生發(fā)展。AS可以被視為動脈壁的慢性炎癥，血液循環(huán)中的單核細胞被趨化并募集至血管壁內(nèi)分化為巨噬細胞。巨噬細胞有M1及M2 2種亞型，其中M1型巨噬細胞通過誘發(fā)炎癥反應具有促進AS的作用。

AGEs與細胞表面的RAGE結(jié)合后，可激活細胞內(nèi)NADPH氧化酶導致細胞氧化應激，表現(xiàn)為細胞內(nèi)ROS的大量聚集。本研究顯示，隨著外源性AGEs濃度的不斷升高，巨噬細胞內(nèi)ROS水平升高。TLR4是巨噬細胞表面識別病原相關(guān)分子模式的識別受體之一。TLR4信號通路的激活被證實與AS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果表明，巨噬細胞內(nèi)ROS水平的升高導致了TLR4信號通路的激活，表現(xiàn)為TLR4表達水平的增加，這與本課題組的前期研究結(jié)果相符。FPS-ZM1是RAGE的拮抗劑，可通過阻斷AGEs與RAGE的結(jié)合進而抑制其下游信號的激活。結(jié)果表明，對RAGE的特異性阻斷可使AGEs誘導的巨噬細胞內(nèi)ROS含量及TLR4表達水平降低。上述結(jié)果表明在巨噬細胞內(nèi)，RAGE/ROS/TLR4可構(gòu)成信號通路并可由AGEs激活。

本研究顯示，AGEs作用后，巨噬細胞表面M1型標記物iNOS表達水平升高，表明AGEs可使巨噬細胞發(fā)生M0型向M1型的極化。STAT通路在哺乳動物細胞高度保守，對諸如細胞生長、凋亡以及免疫應答等均具有調(diào)控作用。STAT1是TLR4的下游效應因子，TLR4信號通路激活后，可指導STAT1在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生磷酸化，形成二聚體后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，作用于例如iNOS等靶基因的啟動子。既往研究表明，STAT1是巨噬細胞發(fā)生M1型極化的關(guān)鍵通路之一。TAK-242通過結(jié)合TLR4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導。本研究還表明，以TAK-242及FPS-ZM1分別對TLR4和RAGE的特異性阻斷均可顯著抑制巨噬細胞內(nèi)STAT1的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，抑制AGEs誘導的巨噬細胞M1型極化。