馬忠英，張 迪，孫 金，牛 靜，任 茜，武倩雯，王婧雯

腦缺血引起的神經(jīng)元壞死和活性氧釋放觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)，血腦屏障受損，過(guò)量的免疫細(xì)胞進(jìn)入腦組織，與腦內(nèi)固有免疫相互作用，放大炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。炎癥反應(yīng)貫穿腦損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，將有可能減輕腦損傷程度。連翹具有清熱、抗炎等功效，連翹酯苷A(forsythoside A，F(xiàn)A)是其主要成分之一。FA可抑制低糖低血清、谷氨酸和Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，此外， FA表現(xiàn)出很好的抗炎效果。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)疾病模型研究。該研究擬在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究FA對(duì)氧糖剝奪/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)引起的PC12細(xì)胞損傷的作用，并闡明作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

藥品和試劑

FA(純度>98%)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBICO公司；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor - alpha，TNF-α)和IL-6購(gòu)自上海碧云天生物有限公司；Toll樣受體4 (toll-like receptor-4，TLR4)、I-κB、P-I-κB、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B (nuclear factor kappa B，NF-kB)、PCNA和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling 公司；TLR4慢病毒激活顆粒、NF-κB慢病毒激活顆粒和轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；其余試劑均是分析純。

1.1.2 儀器

低溫離心機(jī)、CO培養(yǎng)箱、低氧小管和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；凝膠電泳系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.1.3 細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基按1 ∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，收集細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕臃N于96孔板或者6孔板中，進(jìn)行藥物處理和造模。實(shí)驗(yàn)分組(

n

=6)：正常(正常條件培養(yǎng))、模型(OGD/R)和給藥組(1.25、2.5和5 μmol/L，細(xì)胞預(yù)處理24 h后，進(jìn)行OGD/R)。FA的給藥劑量根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選而來(lái)。

1.3 OGD/R模型

給藥組采用FA預(yù)處理24 h，然后將含藥培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放置于含95% N的缺氧小室中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，低氧結(jié)束后，將無(wú)血清培養(yǎng)液換成含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h，完成再?gòu)?fù)氧。模型組再灌注時(shí)給予正常培養(yǎng)基進(jìn)行再灌注，正常組采用正常培養(yǎng)基在正常條件下培養(yǎng)。收集各組細(xì)胞，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行處理。

1.4 炎癥因子測(cè)定

收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，在1 500 r/min，4 ℃條件下離心5 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后測(cè)定培養(yǎng)基中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量，每個(gè)樣本設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，450 nm測(cè)定各孔吸光度值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中炎癥因子的濃度。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine 3000進(jìn)行。選擇合適密度細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h；用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000，充分混合并標(biāo)記為1號(hào)管；用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒制成預(yù)混液，充分混合并標(biāo)記為2號(hào)管；1號(hào)和2號(hào)管混合，充分混勻，室溫孵育15 min，制成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物滴加入需轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)處理。

1.6 Western blot

檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后，收集各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液在4 ℃裂解20 min，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，分裝，在-20 ℃冷凍保存。用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定每組的蛋白質(zhì)含量。10% SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉60 min后，孵育一抗(TLR4、I-κB、P-I-κB、NF-κB p65、PCNA和GAPDH抗體，1 ∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜。洗凈一抗后，孵育羊抗兔二抗，60 min，37 ℃。最后，TBST洗凈殘余二抗后，ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，掃描灰度值，計(jì)算與正常組的比值。內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Graphpad Prism 9.0進(jìn)行分析，用表示，各組間的比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FA抑制炎癥因子水平

如圖1所示，正常組與模型組上清液中IL-1β含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=46.13，

P

<0.01)。正常組上清液中TNF-α含量與模型組上清液中IL-1β含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=70.51，

P

<0.01)。正常組上清液中IL-6含量與模型組上清液中IL-1β含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=10.68，

P

<0.01)。這些結(jié)果表明OGD/R使PC12細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。與模型組比較，F(xiàn)A使細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)，并且呈劑量依賴(lài)關(guān)系，表明FA可抑制OGD/R引起的炎癥反應(yīng)。

圖1 FA對(duì)炎癥因子水平的影響

2.2 FA對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)移的影響

如圖2所示，模型組細(xì)胞內(nèi)P-I-κB和NF-κB p65細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量均增加，并且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=58.24，

F

=47.67，

P

<0.01)。同時(shí)，圖2B結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)量增加(

F

=49.27，

P

<0.01)，表明OGD/R不僅促進(jìn)NF-κB p65蛋白表達(dá)，還可促進(jìn)其轉(zhuǎn)移入核。而FA處理組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)P-I-κB和NF-κB p65表達(dá)量降低(

P

<0.01)，同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)量也減少，并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)，表明FA可抑制NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。

2.3 FA通過(guò)抑制NF-κB調(diào)控炎癥反應(yīng)

為驗(yàn)證FA的抗炎作用是否通過(guò)調(diào)控NF-κB，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)NF-κB。如圖3A所示，過(guò)表達(dá)NF-κB使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)量均增加，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。如圖3B所示，過(guò)表達(dá)NF-κB后，F(xiàn)A對(duì)細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)的抑制作用減弱，與FA處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=143.6，

P

<0.01)。同時(shí)，F(xiàn)A對(duì)IL-6的抑制作用被減弱(

F

=70.88，

P

<0.01)，表明FA通過(guò)NF-κB發(fā)揮抗炎作用。

2.4 FA對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，模型組細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)量增加，且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=59.01，

P

<0.01)，表明OGD/R可以激活細(xì)胞內(nèi)TLR4通路。而FA處理組，TLR4蛋白表達(dá)量被抑制，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)，表明FA可抑制TLR4的蛋白激活。

圖2 FA對(duì)NF-κB表達(dá)的影響

圖3 FA通過(guò)抑制NF-κB抑制炎癥反應(yīng)

圖4 FA對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響

2.5 FA通過(guò)TLR4調(diào)控NF-κB活性

為驗(yàn)證FA是否通過(guò)TLR4發(fā)揮抗炎作用，采用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)TLR4。如圖5A所示，過(guò)表達(dá)使TLR4蛋白表達(dá)量增加，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)，課題組還觀察到FA可使TLR4表達(dá)減少，進(jìn)一步說(shuō)明FA對(duì)TLR4具有抑制作用。圖5B結(jié)果顯示，與scrb+FA組比較，過(guò)表達(dá)TLR4組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(

F

=206.5，

P

<0.01)，表明過(guò)表達(dá)TLR4使FA對(duì)NF-κB的抑制作用減弱。同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示(圖5C)，過(guò)表達(dá)TLR4使細(xì)胞內(nèi)IL-6含量升高(

F

=57.32，

P

<0.01)，與FA+scrb組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明過(guò)表達(dá)TLR4FA對(duì)炎癥的抑制作用減弱。

3 討論

炎癥反應(yīng)在腦缺血和再灌注引起的腦損傷過(guò)程中具有十分重要的作用，并且影響患者的臨床預(yù)后。炎癥反應(yīng)還可與其他腦損傷機(jī)制(氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體應(yīng)激等)交互影響，共同促進(jìn)腦組織損傷。因此，抑制炎癥反應(yīng)是治療腦卒中，改善患者預(yù)后的重要途徑。前期研究表明，F(xiàn)A具有一定的抗炎效果，但是否能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮腦保護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外OGD/R模型，研究了FA的抗炎作用，并初步闡明了可能的作用機(jī)制。

OGD/R可升高細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)的含量，表明OGD/R引起PC12細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。而FA處理組細(xì)胞內(nèi)炎癥因子水平被抑制，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明FA可抑制細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)A在PC12細(xì)胞模型上具有抗炎效果。

圖5 FA通過(guò)TLR4調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)

為闡明FA的抗炎作用機(jī)制，本研究測(cè)定了TLR4/NF-κB信號(hào)通路。TLR4是在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR，在炎癥免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。機(jī)體內(nèi)的炎癥因子可識(shí)別TLR4并與其結(jié)合，誘導(dǎo)下游通路激活，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)，這種誘導(dǎo)放大效應(yīng)可加重炎癥反應(yīng)和組織損傷。TLR4通過(guò)髓樣分化因子88促使NF-κB和I-κB解離，NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與其核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，誘導(dǎo)炎癥因子(TNF-α和IL-6等)釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生和加重炎癥反應(yīng)。因此，有效抑制TLR4/NF-κB通路可阻斷炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)關(guān)系，減輕炎癥反應(yīng)和組織損傷。

本研究結(jié)果顯示，OGD/R不僅升高細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65的表達(dá)水平，同時(shí)細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)水平也增加，表明FA激活NF-κB p65通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證FA對(duì)NF-κB的調(diào)控作用，采用慢病毒顆粒過(guò)表達(dá)NF-κB，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)NF-κB使FA對(duì)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)的抑制作用減弱，同時(shí)失去對(duì)IL-6的抑制作用，表明FA通過(guò)抑制NF-κB抑制炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步明確FA對(duì)TLR4的調(diào)控作用，測(cè)定了TLR4的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)A可抑制TLR4表達(dá)，同時(shí)采用慢病毒質(zhì)粒進(jìn)一步證實(shí)FA通過(guò)TLR4調(diào)控NF-κB發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，F(xiàn)A能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減少炎癥因子釋放，從而減輕細(xì)胞炎癥損傷。本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用FA提供理論基礎(chǔ)，將加速該藥的推廣應(yīng)用。