王肖肖，王 勝

七氟烷是臨床上廣泛使用的一種麻醉藥物，常被用于孕婦和嬰幼兒的全身麻醉。七氟烷發(fā)揮功能時對機體的神經(jīng)發(fā)育有何影響，現(xiàn)已成為臨床上研究的熱點和難點之一。小鼠和大鼠的體內(nèi)研究表明，七氟烷的長時間處理會導致腦內(nèi)神經(jīng)干/前體細胞凋亡，同時損害神經(jīng)再生的能力，從而對小鼠的認知產(chǎn)生消極影響。但是在動物體內(nèi)進行研究難以實時觀察實驗結(jié)果，而且嚙齒類動物的生理特征與人差異較大。人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)在體外不僅可以自我更新，還能夠分化成不同類型的細胞。相較于人神經(jīng)干/前體細胞，hESCs是研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完整周期的絕佳體外模型之一。但是hESCs的體外培養(yǎng)條件較為苛刻，導致以hESCs作為體外模型的相關(guān)研究進展較慢。該研究檢測了不同劑量七氟烷對hESCs的干性維持和神經(jīng)定向分化的影響，并初步探討了下游的分子機制，為未來在臨床上安全使用麻醉藥物提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HES2hESCs由安徽大學干細胞及轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心友情提供；細胞培養(yǎng)基DMEM/F12、Neurobasal Medium、N2、B27、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、血清替代物購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光實時定量PCR試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；GAPDH、OCT4、GATA4、TUJ1、SMAD、ERK、CASPASE 3 (CASP3) 和PAX6 等抗體購自美國ProteinTech、Cell Signaling Technology和Santa Cruz等公司；Activin A和bFGF等細胞因子購自美國Peprotech公司；熒光實時定量PCR儀、生物安全柜和細胞培養(yǎng)箱等購自美國Thermo Scientific公司；普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡購買自德國萊卡公司；蛋白分析設(shè)備購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1

hESCs的培養(yǎng)與傳代

培養(yǎng)皿用Matrigel稀釋液過夜包被，PBS洗1遍，加入hESCs完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的組成為：24 ml DMEM/F12、24 ml Neurobasal Medium、0.25 ml N2、0.5 ml B27、10% 血清替代物、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸鈉、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇。同時添加終濃度為10 ng/ml Activin A、10 ng/ml bFGF以及2 μmol/L IWR1。當細胞生長密度達80%～90%時，用膠原酶Ⅳ消化，按照1 ∶3或1 ∶5比例進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2

七氟烷處理細胞 將hESCs分成分為3組，在37 ℃條件下，其中2組細胞置于含2.1%或4.1%七氟烷、5% CO和21% O混合氣體的密封盒中，處理6 h。即低劑量組和高劑量組，而未經(jīng)七氟烷處理的細胞(即對照組)則僅暴露于5% CO和 21% O的環(huán)境中。實驗期間，用Drager Vamos監(jiān)測氣體濃度。處理結(jié)束，取出細胞放入37 ℃，含5% CO的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，進行后續(xù)觀察分析。

1.2.3

hESCs神經(jīng)分化 hESCs向神經(jīng)細胞定向分化主要參照James A Thomson研究團隊的方法。步驟稍作改進：hESCs在不含自我更新因子的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，形成擬胚體(embryoid bodies, EBs)，4 d后將懸浮的EBs進行貼壁培養(yǎng)，10 d后會形成類似神經(jīng)球結(jié)構(gòu)，將此神經(jīng)球用Accutase進行消化，貼壁培養(yǎng)，不久會長出神經(jīng)元細胞。

1.2.4

熒光實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 用杭州倍沃醫(yī)學科技有限公司的RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA，利用上海翊圣生物科技有限公司的cDNA Synthesis SuperMix預混試劑合成第一鏈cDNA，接著按照該公司的SYBR Green Mix熒光定量檢測試劑盒的說明書進行qRT-PCR操作?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 引物序列

1.2.5

Western blot檢測 待細胞生長密度達到70%以上，棄培養(yǎng)基，預冷PBS洗1遍，加入200 μl已添加了蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解細胞，BCA法測定總蛋白濃度。經(jīng)10%的SDS-PAGE膠分離各蛋白組分、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移蛋白至0.45 μm PVDF膜上、5%脫脂牛奶室溫封閉2 h、一抗稀釋液(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜、TBST洗滌3遍、HRP標記的二抗室溫孵育1 h、TBST再次洗滌膜等步驟后，使用上海天能科技有限公司的ECL發(fā)光液進行發(fā)光。最后，使用Image J軟件統(tǒng)計各條帶灰度值，并與內(nèi)參比較分析。

1.2.6

免疫熒光 棄去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗2遍，加入含有5% BSA和0.2% Triton X-100的PBS溶液在37 ℃孵育2 h，進行封閉和細胞膜穿孔。棄封閉液，加入含有一抗的稀釋液(1 ∶100)4 ℃過夜，次日用PBS洗3遍，每次5 min。最后加入含有綠色熒光基團488的二抗(稀釋比例均為1 ∶1 000)以及Hoechst染料(稀釋比例均為1 ∶5 000)，37 ℃避光孵育1 h，用PBS漂洗3遍后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度七氟烷處理對hESCs凋亡的影響

3組hESCs生長于正常的干細胞培養(yǎng)基中，待細胞的生長密度達到50%～60%時，給予七氟烷氣體處理6 h。2 d后，對照組和低劑量組中的hESCs克隆表面亮澤，形態(tài)正常，而高劑量組內(nèi)的hESCs表面粗糙、出現(xiàn)較多的空泡結(jié)構(gòu)(圖1A)，表明細胞可能發(fā)生了凋亡。接下來檢測了細胞凋亡的標志物CASP3的表達情況。相比于對照組和低劑量組細胞，高劑量組細胞含有較高的CASP3蛋白(0.827±0.051，

F

=23.87，

P

<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(圖1B、C)。說明高劑量七氟烷處理會誘導hESCs發(fā)生凋亡。

2.2 不同濃度七氟烷處理對hESCs未分化狀態(tài)的影響

hESCs在體外能夠以自我復制的方式進行無限增殖，滿足了基礎(chǔ)研究和臨床應用對細胞數(shù)量的要求。本課題組接下來延長觀察時間，以明確七氟烷對hESCs自我更新的影響。細胞傳了2代之后，部分高劑量組內(nèi)的hESCs的克隆邊緣出現(xiàn)了分化表型(圖2A)。未分化的hESCs具有很高的堿性磷酸酶活性，且高表達

OCT

4、

SOX

2和

NANOG

等標志基因，而低表達分化基因。檢測結(jié)果顯示：與對照組和低劑量組細胞相比，高劑量組中的hESCs具有較低的堿性磷酸酶活性(圖2B)，自我更新的標志基因

OCT

4、

SOX

2、

NANOG

和

PRDM

14表達下降，而分化相關(guān)基因

GATA

4和

GATA

6的表達水平較高(

F

=82.34、60.02，

P

<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(圖2C)。在蛋白水平上，Western blot檢測OCT4和GATA4的蛋白水平與轉(zhuǎn)錄組水平上的檢測結(jié)果一致(

F

=16.70、107.80,

P

<0.01)(圖2D、E)，差異有統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明高劑量的七氟烷不利于hESCs未分化狀態(tài)的維持。

圖1 細胞凋亡檢測

圖2 hESCs自我更新的變化

2.3 不同濃度七氟烷對hESCs向神經(jīng)細胞定向分化的影響

七氟烷主要通過人體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮麻醉功能，為了檢測七氟烷是否影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生，本研究將對照組和實驗組的hESCs向神經(jīng)細胞分化(圖3A)。圖3B顯示，hESCs成功地分化成了神經(jīng)元細胞，神經(jīng)元的標志基因

TUJ

1免疫染色顯示為陽性。但相比較于對照組和低劑量組，高劑量組處理中的hESCs分化出的神經(jīng)元細胞較少，神經(jīng)細胞的標志基因

TUJ

1、

ASCL

1和

MAP

2的mRNA表達較低(圖3B、C)，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=7.636、6.975、5.511，

P

<0.05)。蛋白水平檢測也顯示神經(jīng)細胞標志蛋白PAX6和

TUJ

1的水平下降(

F

=7.224，

P

<0.05;

F

=37.8，

P

<0.01)(圖3D、E)，所以高劑量七氟烷處理會降低hESCs向神經(jīng)細胞分化的效率。

2.4 七氟烷調(diào)控hESCs自我更新和神經(jīng)定向分

化的下游機制

hESCs維持多能性依賴細胞因子Activin A和bFGF，前者主要通過TGFβ/SMAD信號通路，后者主要通過FGF/MEK/ERK信號通路。為了檢測不同濃度的七氟烷是否影響TGFβ/SMAD和FGF/MEK/ERK信號通路的活性，本研究分別檢測了這2個通路中的關(guān)鍵蛋白，即磷酸化和非磷酸化的SMAD和ERK蛋白。相比較于對照組和低劑量組hESCs，高劑量處理組細胞中的SMAD2的總蛋白和磷酸化水平均無明顯變化(圖4A、B)，差異無統(tǒng)計學意義。同樣，ERK1的蛋白水平也未發(fā)生變化，而ERK的磷酸化水平出現(xiàn)下調(diào)(

F

=10.39，

P

<0.05)(圖4C、D)，差異有統(tǒng)計學意義。說明高劑量的七氟烷會抑制細胞內(nèi)ERK信號的活性。

圖3 hESCs向神經(jīng)分化的效率檢測

3 討論

胚胎干細胞 (embryonic stem cells, ESCs)為在體外研究七氟烷對胚胎早期發(fā)育的影響提供了良好的模型，前期以小鼠ESCs為研究對象顯示：4.1%七氟烷處理會抑制小鼠ESCs自我更新能力，主要涉及的機制可能與非編碼RNA密切相關(guān)。如七氟烷會上調(diào)非編碼RNA

let

-7

b

的水平，從而抑制體內(nèi)

Lin

28基因的表達，導致小鼠ESCs的增殖以及神經(jīng)定向分化均出現(xiàn)了降低。Wang et al研究也報道4.1%七氟烷會誘導小鼠ESCs中非編碼RNA miR-7a和miR-7b的表達，進而通過降低多能性基因

Klf

4的轉(zhuǎn)錄水平來抑制小鼠ESCs的自我更新能力。這些研究觀察到的細胞表型與課題組在hESCs中觀察到的表型一致(圖2、3B～E)，即高濃度七氟烷會損害hESCs的自我更新和神經(jīng)定向分化的能力，但涉及的下游機制存在區(qū)別。雖然

Let

-7在hESCs中負性調(diào)控

Lin

28的表達水平，但是

Lin

28發(fā)揮功能的主要方式是促進體細胞重編程為人誘導多能性干細胞，

Klf

4在hESCs中表達量也很低。此外，隨著ESCs向神經(jīng)細胞分化，

let

-7家族的表達水平會上升，所以過表達

let

-7

b

有利于神經(jīng)細胞分化形成，說明在hESCs中七氟烷可能不是通過誘導

let

-7家族的水平來發(fā)揮功能。這些差異結(jié)果可以理解，因為小鼠和人ESCs的生物學特征存在很多不同點。例如，激活ERK信號誘導小鼠ESCs分化，但是促進hESCs多能性的維持。本研究觀察到七氟烷會抑制ERK磷酸化水平(圖4C、D)，所以七氟烷調(diào)控hESCs自我更新可能與ERK的活性降低有關(guān)，進而降低神經(jīng)細胞分化形成的效率。雖然降低ERK活性有利于hESCs進入分化狀態(tài)。但是，ERK信號的激活有利于神經(jīng)干細胞分化為成熟的神經(jīng)細胞，而hESCs分化為成熟的神經(jīng)細胞經(jīng)歷多個階段，包括神經(jīng)干/前體細胞的形成，七氟烷是否影響hESCs分化為神經(jīng)干細胞值得進行進一步研究。此外，七氟烷調(diào)控小鼠ESCs自我更新以及導致神經(jīng)毒性的分子機制多樣，除了

Let

-7調(diào)控信號軸之外，還可能通過抑制長鏈非編碼RNA LncRNARik-203的水平，從而提高miR-466l-3p的表達，導致腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達降低。未來需要深入地在hESCs中挖掘高濃度七氟烷產(chǎn)生毒性的詳細分子機制。

圖4 SMAD和ERK信號蛋白的測定

雖然在多個人成體干細胞中檢測了七氟烷對神經(jīng)細胞早期發(fā)育的影響，但是hESCs分離自人類早期的囊胚，更接近胚胎在母體內(nèi)早期的發(fā)育過程，所以為人類早期發(fā)育研究、藥物篩選、機體修復等提供了絕佳的體外研究模型和原料。本項目基于hESCs揭示了不同濃度七氟烷對早期胚胎增殖以及神經(jīng)發(fā)育的影響，明確了七氟烷發(fā)揮毒性作用的劑量濃度和潛在模式。當前，臨床上麻醉人體時七氟烷使用的濃度一般低于2%，未顯示對人體造成不好的影響，與本研究在細胞水平上觀察到的結(jié)果一致。本項目的研究成果將為未來在特殊情況下使用高劑量的七氟烷提供一定的參考。另外，臨床上麻醉用藥除了七氟烷之外，還有丙泊酚、恩氟烷、米那索龍和普魯泊福等，將來需要詳細地檢測它們在體外對hESCs自我更新和分化的影響以及在體內(nèi)對組織器官發(fā)育的調(diào)控，結(jié)果將為未來在臨床上考慮如何組合使用麻醉藥物提供有用的參考依據(jù)。