張 偉，劉新權(quán)，張 軍，趙 磊，李冬妹，張 蕾

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)從多水平調(diào)控基因表達(dá)，作為腫瘤標(biāo)志物被廣泛關(guān)注。人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1( plasmacytoma variant translocation 1, PVT1 )是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，定位于人類染色體8q24.21，被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中表達(dá)或序列異常，可能成為腫瘤標(biāo)志物，但其機(jī)制需要明確。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)、UCSC與GENCODE的注釋信息分析發(fā)現(xiàn)PVT1與人類抗原R(human antigen R, HuR)存在相關(guān)性。為進(jìn)一步研究PVT1和HuR基因在胃癌中的表達(dá)，課題組分析其與臨床特征的相關(guān)性和對胃癌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第五師醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的胃癌石蠟標(biāo)本40例作為胃癌實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收集距離患者癌灶邊緣3～5 cm的癌旁組織39例作為對照組?；颊咝g(shù)前未進(jìn)行放化療，標(biāo)本由2位病理專家診斷。所用標(biāo)本經(jīng)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，由患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑

PVT1探針購自天津賽爾生物公司，HuR抗體購自英國abcam公司，枸櫞酸鹽緩沖液購自北京中杉金橋生物公司，免疫組化所用試劑、DAB顯色液等購自丹麥DAKO公司。引物及質(zhì)粒于廣州賽誠生物科技有限公司合成；Lip2000購自美國Invitrogen 公司；YBR Green PCR kit 購自德國QIAGEN 公司；β-actin抗體購自美國sigma公司；MTT購于美國Solarbio公司。

1.3 組織芯片制作

根據(jù)HE切片鏡下讀片結(jié)果，標(biāo)記相應(yīng)蠟塊位置。根據(jù)需要將組織芯片排版，記錄在紙上。采用Minicore組織芯片儀確認(rèn)孔針位置和蠟塊邊界，在空白蠟塊上打孔，并在蠟塊標(biāo)記的位置取材，將組織樣本蠟芯取出，注入空白蠟塊的孔中，循環(huán)往復(fù)操作，最終組織芯片制作完成。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。

1.4 原位雜交(in situ hybridization, ISH)檢測lncRNA PVT1的表達(dá)水平

組織芯片切片后于80 ℃干烤2 h，隨后用二甲苯脫蠟，分別浸于100%、85%、75%乙醇。3% HO37 ℃浸泡。滴加0.1 mol/L HCl，孵育;滴加0.5% TritonX-100，孵育30 min，滴加蛋白酶K溶液， 37 ℃孵育30 min，隨后采用4%多聚甲醛固定。取100 μl RNA雜交液，均勻的滴在組織芯片上，預(yù)雜交1 h，溫度為55 ℃。同時(shí)將探針變性，將PVT1探針與雜交液以1 ∶100的比例進(jìn)行稀釋，孵育85 ℃，5 min，隨后孵育37 ℃，3 min。滴加100 μl探針，37 ℃雜交過夜。次日取片，1×PBS洗滌后，采用3%的BSA封閉，30 min。HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體以1% BSA稀釋，滴加后37 ℃孵育2 h。滴加DAB孵育3 min，蘇木精染色，梯度置于酒精、二甲苯中，封片觀察。

1.5 免疫組化(immunohistochemistry, IHC)檢測HuR的表達(dá)情況

將組織切片于80 ℃干烤，2 h后用脫蠟并水化，采用枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)抗原8 min，置于3% HO溶液，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用牛奶封閉1 h，37 ℃，隨后加HuR一抗(1 ∶200)， 置于4 ℃冰箱 孵育過夜。次日，將片盒取出至室溫2 h，加二抗孵育30 min，37 ℃，滴加DAB工作液顯色，1.5 min，浸入水中以終止反應(yīng)，隨后采用自來水沖洗；蘇木精染色，酒精脫水，放入二甲苯中，封片，自然晾干后，鏡下觀察結(jié)果。

1.6 ISH與IHC判讀標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)著色強(qiáng)度和面積判讀結(jié)果。據(jù)強(qiáng)度計(jì)分：未染色計(jì)0;染色較弱計(jì)1+，染色適中計(jì)2+，染色強(qiáng)計(jì)3+。據(jù)著色面積占的比例計(jì)分：未著色計(jì)0；<20%計(jì)1+；20%～50%計(jì)2+；>50%計(jì)3+。將強(qiáng)度乘以面積比例，乘積<1的為陰性，2～4的為1+，5～7為2+，8～9的為3+。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC7901細(xì)胞采用10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于含5% CO的37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.8 采用PVT1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901

根據(jù)NR_003367提供的序列，利用pcDNA3.1(+) 質(zhì)粒，于廣州賽誠生物科技有限公司構(gòu)建PVT1真核表達(dá)載體。采用Lip2000將PVT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，將過表達(dá)PVT1的細(xì)胞作為PVT1實(shí)驗(yàn)組，以空載體vector轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組。

1.9 采用real time PCR檢測PVT1的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，采用TRIzol提取細(xì)胞RNA，以SYBR Green PCR kit做real time PCR以檢測PVT1過表達(dá)效率，PVT1引物序列為, F:5′-GGAAGGTGGAG CGTAAGGA-3′， R:5′- CAATGCCGCCAATCTTGTA -3′。擴(kuò)增片段長度為92 bp。 以β-actin為內(nèi)參，引物序列為F:5′-CCCAGCACAATGAAG ATCAAGATCAT-3′， R:5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。擴(kuò)增長度為102 bp，條件為95 ℃、5 min, 95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。以2來計(jì)算確定擴(kuò)增效率。

1.10 Western blot檢測HuR的表達(dá)

取細(xì)胞加入適量的RIPA裂解液，冰上孵育30 min， 4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，電泳轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶粉的1×TBST封閉2 h，加入一抗(HuR 1 ∶100，β-actin 1 ∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，用1×TBST洗膜3遍，5 min，發(fā)光試劑顯色壓片顯影。

1.11 MTT檢測細(xì)胞增殖

收集狀態(tài)良好的不同組的SGC7901細(xì)胞，采用96孔板，每孔接種2 000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣品4個(gè)復(fù)孔。MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染后1～5 d細(xì)胞的增殖情況。每孔加入10 μl的MTT，濃度為 5 mg/ml，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。于490 nm測吸光度。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料采用

t

檢驗(yàn)。其中MTT采用

t

檢驗(yàn)針對每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PVT1過表達(dá)組和對照組進(jìn)行兩兩比較，以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA PVT1在胃癌組織中的表達(dá)情況

將胃癌與癌旁組織進(jìn)行ISH，顯微鏡下觀察，可以看到胃癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)增高，PVT1在胃癌中的表達(dá)陽性率為72.5%(29/40)，高于對照組，38.46%(15/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.002)，見表1，其中可以看到著色陽性的細(xì)胞胞核、胞質(zhì)著色較深，呈棕褐色顆粒,見圖1。

圖1 lncRNA PVT1的ISH檢測 DAB×200A：胃癌組織；B：癌旁對照組織

2.2 lncRNA PVT1的表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系

lncRNAPVT1在組織中的表達(dá)水平與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等特點(diǎn)的相關(guān)性分析可知，lncRNA PVT1在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(

P

=0.001)和腫瘤分期相關(guān)(

P

=0.004)。見表2。

表1 lncRNA PVT1在胃癌組織與癌旁正常組織中ISH結(jié)果

表2 lncRNAPVT1在胃癌組織中的表達(dá)與病理特點(diǎn)的相關(guān)性分析

2.3 HuR在胃癌組織中的表達(dá)情況檢測

利用與ISH相同的組織芯片進(jìn)行切片，采用免疫組織化學(xué)檢測HuR蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果提示HuR蛋白在胃癌組織中細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有著色，呈褐色顆粒狀，見圖2。HuR蛋白在胃癌中的表達(dá)陽性率為67.5%(27/40)高于正常胃黏膜組織中的表達(dá)28.2%(11/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.001)，見表3。

圖2 IHC)檢測HuR在胃癌和癌旁對照組織中的表達(dá) HE×200

2.4 HuR的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系

HuR的表達(dá)與胃癌臨床病理特點(diǎn)的分析結(jié)果提示，HuR在胃癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(

P

=0.007)、分期(

P

=0.022)和分化(

P

=0.015)密切相關(guān)，但是與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。見表4。

表3 HuR基因在胃癌組織和癌旁對照組織中的表達(dá)分析

表4 胃癌組織中HuR的表達(dá)水平與病理特點(diǎn)的分析

2.5 lncRNA PVT1與HuR的表達(dá)相關(guān)性分析

進(jìn)一步分析PVT1與HuR表達(dá)的相關(guān)性，將同一蠟塊組織中，既檢測到lncRNA PVT1又檢測到原癌基因HuR的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，聯(lián)合分析，結(jié)果顯示PVT1與HuR的表達(dá)具有相似的趨勢，在24例胃癌組織PVT1表達(dá)增高的組織中，HuR的表達(dá)也增高了，其相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)。見表5。

表5 lncRNA PVT1與HuR的表達(dá)分析

2.6 在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA PVT1并檢測HuR的表達(dá)水平

將PVT1過表達(dá)質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染到SGC7901胃癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞RNA，real time PCR檢測PVT1的表達(dá)情況，確認(rèn)PVT1表達(dá)上調(diào)后(

P

=0.004，

t

=8.573)， 采用Western blot技術(shù)檢測過表達(dá)PVT1和空載體轉(zhuǎn)染組中HuR蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PVT1后，胃癌細(xì)胞SGC7901中HuR蛋白的表達(dá)水平也有所增加。見圖3。

圖3 Western blot檢測過表達(dá)PVT1和空載體組 HuR蛋白表達(dá)水平a:對照組；b:PVT1過表達(dá)組

2.7 MTT實(shí)驗(yàn)檢測PVT1過表達(dá)胃癌細(xì)胞的增殖情況

采用MTT法比較PVT1過表達(dá)與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力，由增殖曲線可見過表達(dá)PVT1后，胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖水平增加(

P

<0.05)，表明過表達(dá)PVT1表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。見圖4。

圖4 MTT檢測PVT1過表達(dá)胃癌細(xì)胞增殖情況 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

lncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，有證據(jù)表明，他們是一類功能特殊的有調(diào)節(jié)性的生物分子。lncRNA的表達(dá)具有組織特異性及發(fā)育階段特異性，可從多個(gè)角度調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其功能已涉及到轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控以及基因印跡等，其異常表達(dá)能夠影響細(xì)胞的增殖、遷移侵襲等過程。lncRNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子或聚合酶調(diào)節(jié)臨近基因的表達(dá)是其重要作用機(jī)制之一。

lncRNA的異常變化發(fā)生在腫瘤器質(zhì)性病變之前。因此監(jiān)測此類有特異性的lncRNA對于腫瘤的早期診斷意義重大。例如在乳腺癌的早期診斷中，lncRNA H19被發(fā)現(xiàn)在早期的癌組織中表達(dá)增高，并在循環(huán)系統(tǒng)中，血清水平也異常增高，因此被認(rèn)為是此類癌癥早期診段的分子標(biāo)志物。lncRNA NKILA的低表達(dá)能夠加速結(jié)腸癌的進(jìn)程，已經(jīng)被認(rèn)為是結(jié)腸癌早診的潛在分子標(biāo)志物。Lnc RNA HOTAIR在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)異常增高，可能作為診療的分子標(biāo)志物。但目前胃癌相關(guān)的lncRNA分子標(biāo)志物還尚未確定。

LncRNA PVT1基因所在的區(qū)域是染色體8q24.21，該區(qū)域的變異和異常表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤相關(guān)，在結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌等患者中均發(fā)現(xiàn)表達(dá)增高級拷貝數(shù)增加。在胃癌相關(guān)lncRNA的研究中，Cao et al采用了lncRNA芯片比較了胃癌與癌旁組織的lncRNA，發(fā)現(xiàn) PVT1 在胃癌組織中表達(dá)增加。Li et al通過生物信息學(xué)方法，分析了PVT1相關(guān)的蛋白，發(fā)現(xiàn)HuR是與PVT1非常相關(guān)的蛋白質(zhì)。HuR屬于胚胎致死性異常視覺蛋白ELAV家族，可以通過與RNA 3′-非翻譯區(qū)中富含-U或者-AU的腺苷酸和尿苷酸富集元件結(jié)合而增加RNA的穩(wěn)定性，已被證明與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān) 。Zhang et al發(fā)現(xiàn)在肺癌中HuR可以通過影響CDK3的表達(dá)的方式影響腫瘤的演進(jìn)。在結(jié)腸癌中，Jun/miR-22/HuR軸也被發(fā)現(xiàn)是潛在的治療靶點(diǎn)。

在本研究結(jié)果中，本課題組發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中，PVT1表達(dá)上調(diào)，且與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)。在同一組織檢測的HuR表達(dá)與PVT1呈現(xiàn)了共同的趨勢，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)具有相關(guān)性，這證明了在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，PVT1和HuR的異常表達(dá)發(fā)揮了一定的作用。在進(jìn)一步的胃癌細(xì)胞的研究中，當(dāng)上調(diào)PVT1時(shí)，HuR蛋白被檢測到表達(dá)增加，且細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)了，說明PVT1在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制有可能涉及HuR的異常表達(dá)，其可能是通過HuR穩(wěn)定一些癌基因的表達(dá)水平，從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的目的。

LncRNA也是一種分子海綿，可通過吸附miRNA的方式，降低miRNA的水平，從而促進(jìn)了一些基因的表達(dá)，PVT1是否是通過PVT1/miRNA/HuR軸的方式來調(diào)控影響胃癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證，其中的miRNA究竟是什么，也需要進(jìn)一步探究。本研究證實(shí)了PVT1和HuR的異常表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到了作用，是胃癌治療的候選靶點(diǎn)。