寧光耀，張仁泉，黃云龍

食管癌是全世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有病死率高、男性多于女性等特點(diǎn)，其發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)。盡管許多影響食管癌發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素已被證實(shí)，但其具體的機(jī)制尚未闡明。甾醇氧乙?；D(zhuǎn)移酶(sterol O-acyltransferase，SOAT)-1可催化細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)換成膽固醇脂類，并維持細(xì)胞內(nèi)的膽固醇穩(wěn)態(tài)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)SOAT包含2個(gè)亞型：SOAT1和SOAT2，SOAT1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)記酶，廣泛表達(dá)于所有組織類型，而SOAT2僅在腸道和肝臟中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，SOAT1在多種腫瘤中的影響已被報(bào)道，其中包括肝細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌以及結(jié)腸腺癌。然而，目前尚無報(bào)道闡明SOAT1在食道鱗狀細(xì)胞癌中的作用。因此，該研究主要從細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)闡明SOAT1異常表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的調(diào)節(jié)作用，為今后的臨床治療提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細(xì)胞株

選用的食管癌細(xì)胞株(KYSE 510、KYSE 450、KYSE 150和KYSE 30)和食道上皮細(xì)胞(Het-1a)均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2

主要試劑和儀器

RPMI Medium 1640 basic培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，無支原體新生牛血清(杭州四季青有限公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國ThermoFisher公司)，Transwell小室(美國Corning生物科技有限公司)，Cell Counting Kit -8(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國ThermoFisher公司)，SOAT1抗體(美國Abcam公司)，GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋公司)，Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒(美國BD Biosciences公司)，Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real Time PCR試劑盒(北京Takara生物醫(yī)學(xué)公司)。2條SOAT1特異性siRNA均由上海吉瑪生物科技有限公司合成，靶序列分別為：CCCACUCAUUUGUCAGAGA，CUCUUCAUGUUCUUUGGAA。酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD生物科學(xué)有限公司)，化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技公司)。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為5% CO、37 ℃。

1.2.2

siRNA干擾

當(dāng)KYSE 30細(xì)胞處于生長(zhǎng)指數(shù)期時(shí)，在6孔板中進(jìn)行接種。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，按照《lipofectamine 2000操作說明書》進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。分別取100 pmol /ml siRNA和3 μl lipofectamine 2000加入到2支含100 μl Opti-MEM培養(yǎng)基的1.5 ml離心管中混勻室溫放置5 min，將2支離心管內(nèi)液體混勻室溫放置15 min，最后分別均勻加入到每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)。

1.2.3

細(xì)胞增殖檢測(cè)

在96孔板中接種KYSE30細(xì)胞，密度為5 000個(gè)/孔。經(jīng)不同處理后，加入10 μl CCK-8溶液并混勻，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.2.4

劃痕實(shí)驗(yàn)

當(dāng)KYSE30細(xì)胞處于生長(zhǎng)指數(shù)期時(shí)，按1×10個(gè)/ml的密度在6孔板中接種。24 h后換成含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。采用200 μl 槍頭在培養(yǎng)孔底部劃出水平劃痕，并用PBS洗去漂浮細(xì)胞，用含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。置于光學(xué)顯微鏡下拍照，經(jīng)過不同轉(zhuǎn)染處理后，48 h再次進(jìn)行拍照。

1.2.5

Transwell實(shí)驗(yàn)

首先制備預(yù)鋪Matrigel膠的transwell小室，Matrigel膠和RPMI 1640培養(yǎng)基的比例為6 ∶1。選取經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10個(gè)/ ml。在上室內(nèi)加入100 μl 細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入600 μl 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出小室，放入4% 多聚甲醛溶液中室溫固定20 min，PBS洗滌后放入1%結(jié)晶紫染色缸內(nèi)進(jìn)行染色15 min，PBS洗滌后置于室溫干燥，擦去小室內(nèi)膜上Matrigel膠和染色細(xì)胞，最后在顯微鏡下拍照。

1.2.6

流式細(xì)胞術(shù)

將KYSE 30細(xì)胞接種于6孔板中，分成對(duì)照(NC)組和siRNA-2組，觀察細(xì)胞凋亡情況。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行染色。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用Flow-jo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7

Western

blot

組織或細(xì)胞采用含1% PMSF的RIPA裂解液進(jìn)行裂解5 min后，在4 ℃環(huán)境下進(jìn)行14 000 r/min離心。取清亮的上清液，并采用BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行蛋白定量。取30 μg 蛋白液依次進(jìn)行SDS-PAGE濃縮、分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1 ∶1 000)，在4 ℃條件下孵育過夜。洗滌3次后，加入二抗，室溫孵育1 h，洗滌后在化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.8

mRNA提取與qRT

-

PCR

采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(美國Axygen公司)進(jìn)行RNA提取。然后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后，采用Real Time PCR試劑盒進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。SOAT1引物序列：F: TTTGCTGACGCTGCTGTAGAACC，R：AAAGGCTTCATTTACTTCCCACATTGC；GAPDH引物購于上海生工生物工程有限公司。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中SOAT1蛋白及mRNA表達(dá)高于癌旁正常組織

收集9例食管癌患者的臨床資料及組織樣本。患者平均年齡為58～75(67.5±6.6)歲，其中男性6例，女性3例。術(shù)后病理診斷報(bào)告均為食道鱗狀細(xì)胞癌，其中低分化5例、中低分化3例、高分化1例。食管癌組織中SOAT1蛋白的表達(dá)高于癌旁組織(圖1A)，且SOAT1 mRNA 表達(dá)亦高于癌旁正常組織(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=4.162，

P

=0.000 7)。

圖1 食管癌患者的配對(duì)癌及癌旁組織中SOAT1蛋白及mRNA表達(dá)水平

2.2 食管癌細(xì)胞系中SOAT1蛋白及mRNA表達(dá)高于食管正常上皮細(xì)胞

選取4株食管癌細(xì)胞系以及Het-1a。如圖2A示，SOAT1蛋白在4株食管癌細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)均不同程度高于Het-1a細(xì)胞。如圖2B示，4株食管癌細(xì)胞系內(nèi)SOAT1 mRNA表達(dá)亦均高于Het-1a細(xì)胞且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=85.72，

P

<0.000 1)。

圖2 SOAT1蛋白及mRNA在食管癌細(xì)胞及食道上皮細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 siRNA敲低KYSE30細(xì)胞內(nèi)SOAT1蛋白及mRNA表達(dá)

如圖2所示，KYSE30細(xì)胞系內(nèi)SOAT1蛋白及mRNA表達(dá)相對(duì)較高，因此后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)均采用KYSE30細(xì)胞系。如圖3所示，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA敲低細(xì)胞內(nèi)SOAT1表達(dá)，結(jié)果顯示，與NC組比較，2條SOAT1特異性的siRNA-1/2均可以下調(diào)KYSE30細(xì)胞內(nèi)SOAT1蛋白(圖3A)及mRNA(圖3B)表達(dá)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=42.80，

P

=0.000 3)。同時(shí)，本研究選取siRNA-2繼續(xù)開展功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA后KYSE30細(xì)胞內(nèi)SOAT1蛋白及mRNA表達(dá)

2.4 降低SOAT1表達(dá)可減慢KYSE30細(xì)胞的增殖能力，增加細(xì)胞凋亡比例，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖4A示，降低SOAT1表達(dá)可抑制KYSE30細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(72 h：

t

=5.573，

P

=0.005 1；96 h：

t

=10.73，

P

=0.000 4)；如圖4C示，負(fù)向調(diào)節(jié)SOAT1表達(dá)可增加KYSE30細(xì)胞的凋亡比例(0.62%

vs

6.49%)；Western blot結(jié)果也證實(shí)，敲低SOAT1表達(dá)促進(jìn)了凋亡蛋白cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達(dá)(圖4B)。

圖4 敲低SOAT1表達(dá)對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖、凋亡細(xì)胞比例以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 A：2組細(xì)胞增殖變化；B：2組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平；C：2組細(xì)胞內(nèi)凋亡比率變化；與NC組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖5 下調(diào)KYSE30細(xì)胞內(nèi)SOAT1表達(dá)對(duì)其遷移及侵襲的影響×100

2.5 下調(diào)SOAT1表達(dá)可減弱KYSE30細(xì)胞的遷移和侵襲性

如圖5A、B所示，與NC組比較， SOAT1低表達(dá)組KYSE30細(xì)胞的遷移數(shù)目減少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=9.923，

P

=0.000 6)。如圖5C、D示， SOAT1低表達(dá)組KYSE30細(xì)胞的侵襲能力較NC組減弱(

t

=3.357，

P

=0.028 4)。

3 討論

正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化包括體細(xì)胞突變、表觀遺傳改變、代謝重編程和細(xì)胞生長(zhǎng)失控。其中代謝重編程已成為腫瘤生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，關(guān)鍵代謝基因也成為癌癥發(fā)生發(fā)展中重要調(diào)控因子和潛在的治療靶點(diǎn)。SOAT1是一種變構(gòu)酶，它可以利用多種甾醇(包括氧甾醇和植物甾醇等)作為底物和活化劑，其中膽固醇是最優(yōu)的底物和活化劑。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SOAT1不僅參與生酮途徑、異亮氨酸降解和解酮過程而且具有調(diào)控腫瘤增殖及耐藥的能力。研究發(fā)現(xiàn)，SOAT1是前列腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物之一，前列腺癌樣本中出現(xiàn)膽甾醇酯積累，體內(nèi)動(dòng)物模型證實(shí)降低SOAT1介導(dǎo)的膽甾醇酯積累可以抑制前列腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Martinez-Outschoorn et al發(fā)現(xiàn)在MDA - MB - 231細(xì)胞中上調(diào)SOAT1基因，可顯著提高乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力。與此同時(shí)，在結(jié)直腸癌和肺癌中，SOAT1亦可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移。

為探究SOAT1對(duì)食管癌是否具有同樣調(diào)控作用，本研究收集了新鮮的食管癌組織，與正常食道組織比較，癌灶中SOAT1蛋白和mRNA表達(dá)上升。接下來，敲低SOAT1表達(dá)可以減慢食管癌細(xì)胞的增殖速度，促進(jìn)其凋亡，并抑制其遷移及轉(zhuǎn)移能力，這與Geng et al研究結(jié)果類似。然而，在腎細(xì)胞癌中，SOAT1相對(duì)低表達(dá)組患者具有更短的總生存期和無病生存期，且體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SOAT1基因抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移能力。本研究與Geng et al的研究結(jié)果相反，這有可能與納入實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系類型有關(guān)。鹽酸Nevanimibe是SOAT1的抑制劑之一，體外實(shí)驗(yàn)顯示，低劑量可抑制降低腎上腺激素生成，高劑量可引起腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡。一項(xiàng)包含63例腎上腺皮質(zhì)癌患者的多中心的臨床I期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸Nevanimibe的最大耐受安全計(jì)量為6 000 mg/75 kg，但是研究中尚未發(fā)現(xiàn)任何完全緩解或部分緩解的跡象。因此，對(duì)于鹽酸Nevanimibe是否在食管癌臨床中具備安全性和有效性將值得進(jìn)一步探究。綜上所述，敲低SOAT1表達(dá)可負(fù)向調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲能力，這為今后的SOAT1抑制劑臨床治療提供了一定理論依據(jù)。