方金梅,王 凡,孔令玲,趙于飛,方 晶,吳愛林,劉 云

腦膠質(zhì)瘤是成人中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,其惡性程度高、預(yù)后差。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是WHO Ⅳ級(jí)惡性腦膠質(zhì)瘤。其臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為侵襲性生長，通常手術(shù)無法完全切除，而殘存的腫瘤對(duì)放化療不敏感、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差，且中位生存期僅為15個(gè)月。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展是由多因素參與并受多步驟調(diào)控的復(fù)雜過程。研究表明，受體絡(luò)氨酸激酶在大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活是腦膠質(zhì)瘤的重要分子生物學(xué)特征之一。其中，絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、分化及抗凋亡中起到關(guān)鍵的作用。此外，ERK1/2作為MAPK信號(hào)通路重要的下游分子，在腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織中高表達(dá)；體外研究顯示ERK1/2在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株以及膠質(zhì)瘤原代腫瘤細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，而抑制ERK1/2信號(hào)影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和分化。Wang et al發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的培養(yǎng)條件影響人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞中MAPK/ERK1/2信號(hào)通路的激活。母代細(xì)胞的生長狀態(tài)(如處在細(xì)胞生長曲線的指數(shù)期或平臺(tái)期)以及其傳代細(xì)胞的種植密度均對(duì)蛋白激酶ERK1/2的磷酸化產(chǎn)生影響；然而，對(duì)U251細(xì)胞功能的影響及相關(guān)分子機(jī)制尚未闡明。基于此，該研究將設(shè)定4種培養(yǎng)方式來探究不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)U251生長狀況的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞用含10%胎牛血清及100 U/ml青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在37 ℃、5% CO飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞采用胰酶消化，每3～4 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用的U251細(xì)胞傳代次數(shù)均在12次之內(nèi)。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)U251細(xì)胞至指數(shù)期及平臺(tái)期，取相應(yīng)的細(xì)胞重新種植于高密度(8×10/cm)及低密度(2.4×10/cm)[相對(duì)于正常細(xì)胞培養(yǎng)密度(4×10/cm)]?，F(xiàn)設(shè)定以下4種培養(yǎng)方式：① EH，母代處于指數(shù)期的U251細(xì)胞以高密度種植；② EL，母代處于指數(shù)期的U251細(xì)胞以低密度種植；③ PH，母代處于平臺(tái)期的U251細(xì)胞以高密度種植；④ PL，母代處于平臺(tái)期的U251細(xì)胞以低密度種植。在各組細(xì)胞中采用胰酶消化、臺(tái)盼藍(lán)染色后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，繪制生長曲線。

1.3 Western blot檢測

用蛋白裂解液RIPA提取不同培養(yǎng)狀態(tài)及時(shí)間點(diǎn)(6、24、48 h)的U251細(xì)胞蛋白，并利用Bradford法測定總蛋白濃度。采用Western blot檢測各組蛋白表達(dá)量變化，包括p-ERK1/2，cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、P27、cyclinD1、p-PLK、p-FPAK。每組用15～20 μg蛋白加入同體積的2×蛋白上樣緩沖液，于95 ℃ 煮沸5 min，用12% SDS-PAGE將蛋白分離，后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5% BSA室溫封閉1 h，隨后在一抗中孵育、4 ℃過夜。第2天室溫孵育二抗1 h。最終使用ECL 顯色液于暗室曝光顯影。

1.4 半胱天冬酶-3活性實(shí)驗(yàn)

采用比色活性測定試劑盒檢測半胱天冬酶(caspase)-3的活性，操作如下：細(xì)胞在冰上用冰裂解液(50 mmol/L HEPES、100 mmol/L NaCl、0.1% CHAPS、100 μmol/L EDTA、1 mmol/L DTT)裂解，20 μl的細(xì)胞提取物加入70 μl的緩沖液中，并另外加入10 μl熒光底物Ac-DEVD-AFC(用緩沖液稀釋至50 μg/ml)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。在室溫黑暗中孵育1 h后，使用激發(fā)光為405 nm 且發(fā)射光為 505 nm 的熒光讀取器可檢測熒光。同時(shí)，采用Bradford方法檢測每個(gè)樣品的蛋白濃度，最終吸收強(qiáng)度除以蛋白濃度得到caspase3活性定量值，用相對(duì)熒光單位RFU來表達(dá)。

1.5 流式細(xì)胞

流式細(xì)胞用來檢測不同條件下U251細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及Ki67的表達(dá)。胰酶消化后，收集1×10U251細(xì)胞并移至15 ml離心管中，用PBS洗3遍后再重懸到500 μl冰PBS中，重懸液緩慢滴到500 μl冰2% PFA中，在冰上孵育5 min。隨后細(xì)胞重懸至500 μl破膜液0.25% Triton X-100并孵育5 min，最后重懸至100 μl PBS并移至1.5 ml Eppendorf管中。隨后，5 μl Ki67抗體(Alexa Fluor? 647)加入重懸液中，混勻并于室溫黑暗中孵育1 h。之后清洗并將細(xì)胞重懸至500 μl PBS中，加入2 μg/ml PI及50 μg/ml RNA酶，在室溫黑暗中孵育30 min。樣品準(zhǔn)備完畢后在上機(jī)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)使用Flowjo version 10分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方式影響U215的生長曲線

在EH、EL、PH和PL組中，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長曲線。結(jié)果顯示無論EL或PL狀態(tài)下，U251細(xì)胞均快速增殖；在PH狀態(tài)下，細(xì)胞仍繼續(xù)快速生長；而在EH情況下，細(xì)胞增長緩慢(圖1A)。在EH中這種細(xì)胞緩慢增殖的情況，不隨細(xì)胞培養(yǎng)基的更新而改變(圖1B)；并且，在EH組中伴有明顯的細(xì)胞脫壁；統(tǒng)計(jì)顯示，脫壁的細(xì)胞數(shù)占到總細(xì)胞數(shù)的2%～7%，而其余3組未有明顯的脫壁細(xì)胞(圖1C)。

圖1 不同培養(yǎng)條件下U251細(xì)胞的增殖

2.2 EH培養(yǎng)方式導(dǎo)致U251細(xì)胞凋亡

利用Western blot的方法檢測EH組細(xì)胞中凋亡蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示EH組的細(xì)胞在48 h時(shí)cleaved-caspase3和cleaved-caspase8的表達(dá)明顯升高(圖2A)。caspase3活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2B)，即在48 h時(shí)，與PH組相比，EH組的caspase3活性明顯增高(

t

=6.724，

P

=0.002 5)。因此這些結(jié)果提示母代處于指數(shù)期的U251細(xì)胞在重新種植于高密度后發(fā)生了凋亡。

圖2 不同培養(yǎng)條件下在U251細(xì)胞中的caspase-3活性檢測

2.3 EH組中凋亡的細(xì)胞發(fā)生G2阻滯及細(xì)胞周期蛋白下調(diào)

為進(jìn)一步探究不同的培養(yǎng)條件對(duì)U251細(xì)胞生長影響的相關(guān)機(jī)制，對(duì)不同組的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，同時(shí)對(duì)Ki67進(jìn)行染色，以檢測不同周期中細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示在處理后的第1天，4組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布無明顯差異：50%～60%的細(xì)胞在G1期，15%～20%的細(xì)胞在S期，20%～30%的細(xì)胞在G2期，并且所有細(xì)胞中均表達(dá)Ki67。然而，在處理后的第3天時(shí)，PH組中，70%的細(xì)胞處于G1期，15%處于S期，伴有部分Ki67表達(dá)。在EH組G1期的細(xì)胞降至約40%，而G2期約35%并伴有Ki67表達(dá)，提示G2期阻滯。盡管各組都有sub-G1期的細(xì)胞并呈現(xiàn)部分Ki67表達(dá)，但這部分細(xì)胞在EH組的占比高于其他組。另外，當(dāng)細(xì)胞重新種植于低密度時(shí)，PL組和EL組細(xì)胞在第3天只有輕度G1期增高，并且所有細(xì)胞都為Ki67高表達(dá)(圖3A)。Western blot結(jié)果(圖3B)顯示EH組細(xì)胞在24 h后出現(xiàn)明顯的p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)(

t

=38.04,

P

<0.000 1)；EH組細(xì)胞的cyclinD1表達(dá)較PH組低，并且在24 h及48 h可見明顯的下降(

t

=6.219,

P

=0.000 8；

t

=4.344,

P

=0.004 9)，這與生長曲線中第2天生長緩慢的結(jié)果一致。磷酸化PLK1是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期重要的蛋白，EH組細(xì)胞在48 h可見明顯p-PLK1明顯降低(

t

=5.368,

P

=0.001 7)，這也驗(yàn)證了細(xì)胞聚集在G2期。另外，與PH組相比，24 h EH組中p27的表達(dá)明顯上調(diào)(

t

=4.483，

P

=0.001 5)，而以上蛋白的表達(dá)在PL與EL組之間無明顯差異(圖3C)。

2.4 FAK信號(hào)通路對(duì)EH組細(xì)胞凋亡的影響

利用Western blot檢測不同的培養(yǎng)條件下FAK的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖4A及4B)在EH組中，在6 h時(shí)，F(xiàn)AK-Y397磷酸化較PH組明顯下調(diào)(

t

=3.981,

P

=0.007 3)，而Y925的磷酸化只在24 h明顯減少(

t

=3.523,

P

=0.012 5)，而FAK-Y397和Y925的磷酸化表達(dá)情況在PL與EL組無明顯區(qū)別。因此，本課題組猜測FAK的表達(dá)降低可能與細(xì)胞脫壁有關(guān)，并進(jìn)一步驗(yàn)證增加FAK的表達(dá)是否可以阻止細(xì)胞凋亡。把U251細(xì)胞分別種植在包被0.83 mg/ml的膠原蛋白I或者10 ng/ml的纖維連接蛋白fibronectin的培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)基中加入100 ng/ml IGF-1和10 ng/ml TGF-β。Western blot結(jié)果顯示上述處理方式并沒有增加p-ERK1/2的表達(dá)，且EH組仍發(fā)生細(xì)胞凋亡(圖4C)。這個(gè)結(jié)果說明FAK信號(hào)通路的下調(diào)并不是p-ERK1/2減少的原因，而且這種條件下引起的失巢凋亡并不依賴于FAK。

2.5 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27對(duì)EH組細(xì)胞凋亡的影響

在PH與EH組細(xì)胞中，除了ERK以外，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27的表達(dá)也有差異，提示細(xì)胞周期調(diào)控可能參與凋亡過程。將指數(shù)期的母代細(xì)胞饑餓24 h后，利用Western blot檢測顯示p27的表達(dá)增高(圖5A)。為驗(yàn)證p27對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，將指數(shù)期的母代細(xì)胞在0.5%小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，以升高基線p27的表達(dá)，然后再重新種植于高密度，并定義為0 h，繼續(xù)在該培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。之后，將培養(yǎng)基更換為含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基，并收集相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞蛋白。Western blot顯示ERK1/2持續(xù)激活并且無明顯cleaved-caspase3及cleaved-caspase8的表達(dá)，提示無凋亡發(fā)生(圖5B)。另外，生長曲線顯示細(xì)胞快速生長，并無明顯細(xì)胞脫壁(圖5C)。這些結(jié)果證實(shí)上調(diào)p27的表達(dá)可以阻滯EH細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示功能性表達(dá)p27在維持U251細(xì)胞增殖及抗凋亡的重要作用。

圖3 不同培養(yǎng)條件U251細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

圖4 增加FAK的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖5 上調(diào)p27的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

母代細(xì)胞的生長狀態(tài)及細(xì)胞密度對(duì)U251細(xì)胞中MAPK/ER1/2信號(hào)通路的激活有顯著影響。本研究顯示，當(dāng)平臺(tái)期或指數(shù)期細(xì)胞種植于低密度時(shí)(PL和EL)，U251細(xì)胞快速增殖，與母代細(xì)胞狀態(tài)無明顯關(guān)系，2組細(xì)胞生長無差異；將平臺(tái)期U251細(xì)胞種植于高密度時(shí)(PH)，增殖明顯，這與升高的p-ERK1/2結(jié)果一致；將指數(shù)生長的U251細(xì)胞種植于高密度時(shí)(EH)，增殖緩慢，這與ERK1/2磷酸化受抑制相關(guān)。EH組細(xì)胞同時(shí)伴隨明顯的細(xì)胞脫落，通過檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase的激活提示細(xì)胞發(fā)生凋亡。

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以及黏附分子表達(dá)的改變，使侵襲性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞不易發(fā)生凋亡。本研究顯示在EH培養(yǎng)條件下，U251細(xì)胞脫壁并發(fā)生凋亡，而Western blot顯示磷酸化FAK的表達(dá)下降。細(xì)胞脫壁的凋亡也稱失巢，通?？杀患せ畹恼澈纤匦盘?hào)通路所抑制。已有研究證實(shí)FAK和TGF-β能夠通過激活粘合素與細(xì)胞外基質(zhì)的相關(guān)作用來介導(dǎo)這種細(xì)胞外基質(zhì)依賴的凋亡。此外，Wang et al推測細(xì)胞密度對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響可能依賴于FAK信號(hào)通路。在本研究中，盡管磷酸化的FAK在EH組細(xì)胞中表達(dá)下降，通過添加生長因子或細(xì)胞外基質(zhì)等增加FAK的表達(dá)未能抑制EH細(xì)胞凋亡，也沒有升高EH細(xì)胞p-ERK的表達(dá)。這些結(jié)果提示FAK的表達(dá)下降并不是引起EH細(xì)胞凋亡的原因，而是伴隨細(xì)胞脫壁產(chǎn)生的結(jié)果。

PH與EH組細(xì)胞中p27的表達(dá)也有差異，提示細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可能參與凋亡過程。p27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，調(diào)控細(xì)胞進(jìn)入G1期，維持細(xì)胞周期正常的運(yùn)轉(zhuǎn)。p27缺失見于多種腫瘤包括腦膠質(zhì)瘤，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受調(diào)控的增殖。在人成纖維細(xì)胞中，p27缺失導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，而功能性表達(dá)p27可阻止細(xì)胞凋亡。因此，在本研究中引起EH細(xì)胞凋亡的原因可能與指數(shù)生長的U251細(xì)胞低表達(dá)p27導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程失控有關(guān)。在饑餓處理增加p27表達(dá)后，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象消失，進(jìn)一步說明了功能性表達(dá)p27對(duì)維持細(xì)胞存活的重要性。Masuda et al也發(fā)現(xiàn)p27的保護(hù)功能，增加p27表達(dá)可阻止小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，并維持細(xì)胞在不利的培養(yǎng)環(huán)境中存活。在 T98G 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，當(dāng)生長因子缺乏的情況下，S期激酶相關(guān)蛋白2的激活受到抑制，而協(xié)同下調(diào)p27表達(dá)可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡。所以功能性表達(dá)p27在維持腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及抗凋亡中有重要影響。

本研究的結(jié)果對(duì)腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)及臨床研究具有潛在的意義。首先，體外培養(yǎng)過程中如何避免不必要的外界刺激并合理培養(yǎng)細(xì)胞是值得關(guān)注的問題。其次，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長是在一定的調(diào)控下進(jìn)行，如在U251細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑仍具有一定監(jiān)控功能，從而保證細(xì)胞周期進(jìn)程，并且聯(lián)合激活的ERK信號(hào)維持腦膠質(zhì)瘤的增殖及生存。最后，在一定程度上解釋腦膠質(zhì)瘤治療后早期復(fù)發(fā)的原因。來自于平臺(tái)期的細(xì)胞重新種植在高密度或低密度時(shí)都呈現(xiàn)快速增長的趨勢，從轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的角度，腦膠質(zhì)瘤減瘤后殘留的腫瘤細(xì)胞可看作來自于平臺(tái)期的細(xì)胞解除了接觸抑制，促進(jìn)MAPK/ERK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而引起細(xì)胞快速增殖、存活，導(dǎo)致對(duì)放化療抵抗及腫瘤復(fù)發(fā)。然而，本研究結(jié)果仍需其他腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株特別是病人來源的原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加以驗(yàn)證，從而為繼續(xù)研究腦膠質(zhì)瘤的生長調(diào)控以及治療抵抗提供一定的理論基礎(chǔ)。