黃 乾，廖世杰，林成森，劉 云，李波香，陳縣祥，劉建宏，丁曉飛*

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院a:骨科；b:廣西再生醫(yī)學研究中心，廣西南寧530021）

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨腫瘤，兒童、青少年 好發(fā)［1］。骨肉瘤是高度侵襲性和破壞性的腫瘤，疾病早期易發(fā)生周圍的骨骼和血管轉(zhuǎn)移［2］。雖在應(yīng)用新輔助化療后，非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的生存率有一定改善，但復發(fā)或轉(zhuǎn)移患者5年生存率仍低于33%；并且常規(guī)化療常存在嚴重副作用［3～5］。而近20年來骨肉瘤患者的長期生存時間并沒有明顯的提升［6］。

雌激素可通過調(diào)控成骨細胞凋亡來維持骨密度穩(wěn)定［7］。有研究表明，17β-雌二醇（E2）對骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡具有調(diào)控作用［8］。但長期或大量應(yīng)用雌激素會帶來副作用。分子研究表明，植物雌激素在結(jié)構(gòu)上類似于17β-雌二醇（E2），并且可以結(jié)合和激活細胞內(nèi)雌激素受體，只引起輕微副作用［9］。植物雌激素可抑制多種腫瘤細胞［10］。鷹嘴豆芽素A（biochanin-A,BA），是源于豆科植物鷹嘴豆、紅車軸草等的一種異黃酮，具有類雌激素作用［11］。鷹嘴豆芽素A具有多種藥理作用。然而，其對人骨肉瘤細胞的作用研究中較少涉及。本項研究主要探索鷹嘴豆芽素A對MG-63人成骨肉瘤細胞的細胞毒性作用及誘導凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與處理

1.1.1 細胞培養(yǎng)

MG-63細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。MG-63細胞使用含10%胎牛血清、1%100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素（四季青，杭州，中國）的高糖DMEM（Gibco,Life Tech?nologies,美國）培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，使用Trypsin+EDTA消化傳代。

1.1.2 主要試劑

鷹嘴豆芽素A購自中國上海Aladdin公司；MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］購自美國Sigma-Aldrich公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD Pharmingen公司；DAPI核酸染色試劑盒購自中國北京Solarbio公司；兔單克隆抗體phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、p38 MAPK（D13E1）、phospho-p44/42MAPK（ERK1/2） （Thr202/Ty204） 、 p44/42 MAPK （Erk1/2）（137F5）、 Phospho-SAPK/JNK （Thr183/Tyr185）、Caspase-3 （8G10）、Cleaved Caspase-9 （Asp330）、PARP （46D11）、Bax （D2E11）、Bcl-2 （D55G8）、β-Actin（D6A8）和辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；重組兔單克隆抗體 Anti-JNK1+JNK2+JNK3 antibody（EPR18841-95）購自英國Abcam公司。

1.2 檢測指標

1.2.1 MTT檢測

將MG-63細胞［（6～8）×104/ml］接種于96孔板，進入對數(shù)期后用鷹嘴豆芽素A（0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L）在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 和 48 h。將 MTT（20 μl，5 mg/ml）加入到每個孔中。于37℃避光溫育2 h后，向各孔中加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）。使用酶標儀（Spectramax Plus 384,Molecular Devices,美國）在570 nm處獲得吸光度。每個濃度梯度設(shè)置6個復孔，實驗總體重復3次。細胞活性表示為半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察

用DAPI染色評估核形態(tài)的變化。將MG-63細胞（7.5×104/ml）接種在6孔板中，并加入鷹嘴豆芽素 A（0、40、80 μmol/L）處理 24 h。PBS 洗滌后在4%多聚甲醛中固定20 min，并于室溫用10 μg/ml DAPI染料染色10 min。使用熒光顯微鏡觀察隨機視野中捕獲的細胞核形態(tài)。

1.2.3 流式細胞檢測

取MG-63細胞（1.0×105/ml）接種在6孔板中，用鷹嘴豆芽素A（0、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞48 h，PBS洗滌兩次，然后以600 g離心5 min。去除上清液，將500 μl的1X結(jié)合緩沖液加入到細胞中。向細胞中加入Annexin V（FITC,5 μl）和碘化丙啶（PI,5 μl），然后避光孵育15 min。在1 h內(nèi)通過BD Accuri C6流式細胞儀（Becton＆Dickin?son Co.，美國）測定細胞凋亡率。

1.2.4 Western印跡分析

用鷹嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞24 h，總蛋白質(zhì)從MG-63細胞中提取，BCA法檢測總蛋白。將等量的蛋白質(zhì)（40 μg）加入10%～15%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）中電泳，然后直接將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。將膜在5XBSA溶液中室溫封閉1 h；用特異性抗體 p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、β-Actin、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 和PARP在4℃孵育過夜。洗膜后用辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。使用ChemiDOC?XRS+系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories,美國）檢測免疫復合物。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用 GraphPad Prism（版本 7.0,GraphPad Soft?ware,美國）進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以平均值±平均值的標準誤差（SEM）給出。單因素方差分析（ANO?VA）用于比較3個或更多組。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鷹嘴豆芽素A抑制MG-63細胞的活性

將人骨肉瘤MG-63細胞用不同濃度的鷹嘴豆芽素 A（0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）處理 24 h和48 h后使用MTT法測量。MG-63細胞的IC50值在 24 h 為 106.70 μmol/L，48 h 為 75.57 μmol/L。細胞活性顯著下降，并呈時間和劑量依賴性效應(yīng)（圖1）。

圖1 MTT實驗結(jié)果表明鷹嘴豆芽素A可抑制MG-63細胞活性，并呈時間和劑量依賴性效應(yīng)

2.2 鷹嘴豆芽素A誘導MG-63細胞凋亡

用不同濃度鷹嘴豆芽素A（0、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞24 h，DAPI熒光染色后使用熒光顯微鏡觀察。在×200視野下，可明顯觀察到早期凋亡的MG-63細胞，并隨著鷹嘴豆芽素A濃度的增加，細胞量較正常組少，凋亡細胞比例較正常組增多（圖2a～2f）。

用不同濃度鷹嘴豆芽素A（0、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞48 h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，顯示凋亡率以劑量依賴方式增加。與正常組相比，使用40 μmol/L和80 μmol/L鷹嘴豆芽素A處理MG-63細胞明顯促進其凋亡。當鷹嘴豆芽素A濃度為40 μmol/L和80 μmol/L時，細胞凋亡率分別為（45.28±3.79）%和 （82.51±5.23）%，高于正常組（5.31±3.14）%（P<0.001；P<0.001）（圖 2g～2i）。

圖2 鷹嘴豆芽素A誘導MG-63細胞凋亡 2a～2f:不同濃度鷹嘴豆芽素A處理后，DAPI染色觀察凋亡MG-63細胞核形態(tài)改變（倒置顯微鏡，×200），凋亡細胞核染色質(zhì)致密深染（如白色箭頭所示）（2a:正常組，2b:40 μmol/L鷹嘴豆芽素A，2c:80 μmol/L鷹嘴豆芽素A，2d～2f:分別對應(yīng)2a～2c的局部放大區(qū)域） 2g～2i:Annexin V/PI雙染法流式細胞術(shù)結(jié)果表明鷹嘴豆芽素A誘導MG-63細胞凋亡（2g:正常組，2h:40 μmol/L鷹嘴豆芽素A，2i:80 μmol/L鷹嘴豆芽素A）

2.3 鷹嘴豆芽素A促進MAPK通路的磷酸化p38、磷酸化JNK與磷酸化ERK1/2的表達

用不同濃度鷹嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞24 h，使用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆芽素A可促進磷酸化p38蛋白的表達，呈劑量依賴方式。鷹嘴豆芽素A也可促進磷酸化JNK蛋白與磷酸化ERK1/2蛋白的表達，以80 μmol/L最明顯（圖 3a，3b）。

圖3 Western blot檢測鷹嘴豆芽素A促進MG-63細胞MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達 3a:鷹嘴豆芽素A促進MG-63細胞磷酸化p38蛋白、磷酸化JNK蛋白與磷酸化ERK1/2蛋白的表達 3b:相對蛋白表達水平統(tǒng)計分析結(jié)果（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

2.4 鷹嘴豆芽素A可調(diào)控Bcl-2蛋白家族的表達

用不同濃度鷹嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞24 h，使用Western blot檢測主要凋亡途徑蛋白Bcl-2蛋白家族中Bax和Bcl-2基因和蛋白的表達。結(jié)果顯示：鷹嘴豆芽素A以劑量依賴方式上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達（圖4a，4b）。

2.5 鷹嘴豆芽素A可促進caspase蛋白家族的表達

用不同濃度鷹嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）處理MG-63細胞24 h，使用Western blot檢測主要凋亡途徑蛋白caspase蛋白家族。結(jié)果顯示：隨著鷹嘴豆芽素A濃度的增加，cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的表達增加（圖4a，4b）。

圖4 Western blot檢測鷹嘴豆芽素A促進MG-63細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達 4a:鷹嘴豆芽素A促進MG-63細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達 4b:相對蛋白表達水平統(tǒng)計分析結(jié)果（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

3 討論

骨肉瘤嚴重威脅全球年輕人的健康成長，探索新的骨肉瘤治療策略十分重要。本研究結(jié)果顯示鷹嘴豆芽素A以時間和劑量依賴效應(yīng)來抑制MG63細胞的活性，并通過激活p38、JNK信號通路和主要凋亡信號通路Bcl-2家族和caspase家族來誘導細胞凋亡。

細胞凋亡被廣泛認為是一個關(guān)鍵的生理過程，是一種細胞內(nèi)基因和相關(guān)蛋白發(fā)揮作用引起的程序性細胞死亡。細胞死亡或凋亡的失?？蓪е掳┌Y發(fā)生［12］。核質(zhì)濃縮、核膜核仁破碎為細胞凋亡典型形態(tài)學表現(xiàn)［12］。本研究通過DAPI染色，觀察MG-63細胞核的形態(tài)學變化。結(jié)果顯示鷹嘴豆芽素A可誘導MG-63細胞凋亡，并呈濃度依賴效應(yīng)。使用An?nexin V-FITC和PI染色檢測細胞凋亡后，發(fā)現(xiàn)隨著鷹嘴豆芽素A的濃度增高，MG-63細胞的凋亡率增高。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展起重要作用［13］。JNK和p38通路為MAPK通路的重要部分，與凋亡密切相關(guān)［14］。Chen等［15］證實植物雌激素DDTD可通過激活p38信號通路誘導骨肉瘤細胞的凋亡。Modrowski等［16］證實過表達syndecan-2可活化p38和JNK通路誘導骨肉瘤細胞凋亡。本研究通過Western blot實驗檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白，顯示鷹嘴豆芽素A可上調(diào)磷酸化p38，磷酸化JNK和磷酸化ERK1/2的表達。

Bcl-2家族中的促凋亡和抗凋亡基因相互影響來維持細胞平衡［17］。Bcl-2是公認的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的抗凋亡因子。組織和器官中的促凋亡因子Bax在線粒體外膜上廣泛表達。Bcl-2和Bax的相互拮抗對腫瘤細胞凋亡的調(diào)控起重要作用。線粒體通路為細胞凋亡主要通路之一［18］。在啟動階段，線粒體釋放細胞色素 C激活 caspase家族，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)［19］。Cho等［20］研究表明，鷹嘴豆芽素A可以通過上調(diào)Bax，下調(diào) Bcl-2，促進 cleaved caspase-9、cleaved cas?pase-3和cleaved-PARP的表達來誘導咽鱗癌細胞凋亡。本研究通過Western blot實驗證實，鷹嘴豆芽素A通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax的表達誘導骨肉瘤細胞凋亡。同時檢測到凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved-PARP隨著鷹嘴豆芽素A濃度的增加而增加，提示鷹嘴豆芽素A可誘導人成骨肉瘤細胞凋亡。

總之，植物雌激素鷹嘴豆芽素A可以抑制人成骨肉瘤MG-63細胞的活性，并通過激活MAPK/凋亡信號通路誘導細胞凋亡。其可以作為治療骨肉瘤的一種潛在的新藥物。但鷹嘴豆芽素A其他的抗腫瘤機制仍未完全明確，仍需更深層次的多方面探討。