劉金龍，孫曉彤，張玉娟，杜 慶，孫剛和，劉相成*

（1.中國人民解放軍陸軍第八十集團軍醫(yī)院骨科，山東濰坊261042；2.濰坊醫(yī)學院麻醉學院，山東濰坊261053）

α-硫酸鈣 （α-calcium sulphate hemihydrate,α-CSH）作為一種優(yōu)良的骨缺損修復(fù)材料，已經(jīng)有100多年的應(yīng)用歷史［1］，針對其臨床應(yīng)用中代謝速度快、強度不足等應(yīng)用缺陷，既往通過將α-CSH與殼聚糖、透明質(zhì)酸、聚乳酸、羧甲基纖維素等高分子聚合物復(fù)合后，理化性質(zhì)顯著提高［2］，其應(yīng)用缺陷相應(yīng)得到一定程度改善，但仍不能完全滿足臨床應(yīng)用需求。納米纖維素（nanocellulose,NC）作為一種自然來源的天然高分子納米材料，不僅具有較好的生物安全性及組織兼容性［3］，而且具有納米材料比表面積大、長徑比高、機械強度優(yōu)異的性能，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域尤其是骨科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［4］。作者前期研究中利用納米纖維素增強α-CSH的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使α-CSH理化性質(zhì)顯著提高［5］，本研究將進一步通過動物骨缺損模型檢驗α-CSH/NC復(fù)合植骨材料的骨缺損修復(fù)特性［6，7］。

1 材料和方法

1.1 植入材料的準備

α-CSH由Sigma公司生產(chǎn)提供，α-CSH/NC復(fù)合植骨材料由前期制備所得，利用自制單向軸壓模具，分別制作直徑6 mm，高度為8 mm的圓柱狀植入物，放入37℃、100%濕度恒溫恒濕箱中，待其凝固后從模具中取出，放入40℃鼓風干燥箱中烘干24 h，于本院消毒供應(yīng)室采用環(huán)氧乙烷消毒滅菌，無菌包裝密封待用。

1.2 動物及手術(shù)操作

封閉群新西蘭白兔12只，雌雄不限，體重（3.12±0.25）kg，由濟南鵬悅實驗動物繁育有限公司提供［許可證：SCXK（魯）2019-003］。隨機將動物分為2組，每組6只。戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈麻醉，刮除股骨外髁處毛發(fā)，用碘伏消毒。每組動物右股骨髁設(shè)為空白對照，共12處，左股骨髁設(shè)為植入側(cè)，α-CSH組以及α-CSH/NC組各6處。以股骨外髁最高點處為中心縱行切開長約2 cm手術(shù)切口，逐層分離至骨膜下，應(yīng)用低速限深環(huán)鉆于股骨外髁處鉆取直徑為6 mm，深度為8 mm的圓柱樣骨缺損區(qū)域，生理鹽水沖洗創(chuàng)口。α-CSH組以及α-CSH/NC組分別植入相應(yīng)的材料后縫合創(chuàng)口；空白組給予生理鹽水沖洗后，不植入任何材料，縫合創(chuàng)口。

所有動物均于術(shù)后3 d連續(xù)靜脈注射青霉素80 IU/d預(yù)防感染。分別于術(shù)后4、12周通過靜脈注射空氣處死每組中的動物，并取股骨髁處標本，剝離周圍軟組織后放入4%的低聚甲醛溶液中浸泡固定，然后將標本依次放入70%、80%、90%、95%、100%濃度的乙醇中進行脫水。

1.3 Micro-CT掃描

將取材的兔子股骨髁標本行SCANCO Micro-CT掃描（掃描電壓90 kV，電流88 mA，掃描層厚為50 μm），對術(shù)后4周處死動物標本中植入物的殘留量進行分析，觀察骨長入情況，對術(shù)后12周處死動物標本以植入物中軸線為中心，應(yīng)用Micro-CT自帶軟件計算所獲得的斷層圖像中心周緣3 mm范圍內(nèi)的骨表面積、骨體積、相對骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁分離度等骨小梁形態(tài)參數(shù)［8］。

1.4 硬組織切片

將獲取的兔股骨髁標本應(yīng)用T7200vlc光聚樹脂包埋，包埋后自然硬化1周，應(yīng)用Leica SM2500硬組織切片機進行硬組織切片，Van Gieson（VG）染色后進行成骨形態(tài)分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料呈正態(tài)分布，以±s表示，采用單因素方差分析統(tǒng)計，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有動物均能耐受手術(shù)，且術(shù)后48 h后可自由活動，術(shù)后2周1只α-CSH組實驗動物、術(shù)后8周1只α-CSH/NC組實驗動物因感染導(dǎo)致死亡退出實驗，其余實驗動物創(chuàng)口愈合良好，于4周及12周時間節(jié)點順利取材。

2.2 Micro-CT掃描形態(tài)觀察

術(shù)后4周所取股骨髁標本經(jīng)Micro-CT掃描所得二維矢狀切面圖像及三維重建圖像見圖1a～1f，圖示空白組鉆孔處邊緣清晰，未見明顯新骨長入（圖1a，1d），α-CSH組植入物少量殘留，殘留體積約為（5.54±0.45）%（圖 1b，1e），而 α-CSH/NC 組植入物體積仍殘留約（53.02±3.23）%（圖1c，1f），兩種不同植入物殘存差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示復(fù)合材料的體內(nèi)代謝速率明顯降低。

術(shù)后12周所取股骨髁標本經(jīng)Micro-CT掃描所得二維矢狀切面圖像及三維重建圖像見圖1g～1l，術(shù)后12周兩組植骨材料已經(jīng)完全吸收，三組骨缺損區(qū)域均存在不同程度的新生骨，以α-CSH/NC組生成骨小梁最為致密（圖1i）。三維重建圖片可見空白組外口處骨缺損較多（圖1j），α-CSH組外口未完全閉合，中央?yún)^(qū)域仍可見骨缺損（圖1k），α-CSH/NC組外口處基本閉合，骨缺損區(qū)域不顯著（圖1l）。

圖1 兔股骨髁標本Micro-CT掃描形態(tài)所見 1a:術(shù)后4周空白組矢狀切面，股骨髁骨洞處呈空洞狀，骨洞中央未見新生骨 1b:術(shù)后4周α-CSH組矢狀切面，股骨髁骨洞內(nèi)可見少量植入物殘留 1c:術(shù)后4周α-CSH/NC組矢狀切面，股骨髁骨洞內(nèi)可見明顯植入物，植入物周緣處開始吸收 1d:術(shù)后4周空白組三維重建圖像，可見股骨髁骨洞處呈空洞，周緣骨壁清晰 1e:術(shù)后4周α-CSH組三維重建圖像，股骨髁骨洞內(nèi)可見少量殘留植入物，植入物外觀不完整，大部分被吸收 1f:術(shù)后4周α-CSH/NC組三維重建圖像，股骨髁骨洞內(nèi)植入物清晰可見，同骨壁接觸處可見明顯縫隙，說明植入物部分被吸收1g:術(shù)12周空白組矢狀切面，股骨髁骨洞處可見新骨生長，骨洞中央仍可見明顯缺損 1h:術(shù)后12周α-CSH組矢狀切面，可見股骨髁骨洞周緣少量新骨生長，骨洞中央無新生骨長入 1i:術(shù)后12周α-CSH/NC組矢狀切面，可見股骨髁骨洞內(nèi)充滿新骨，中央處空洞需仔細分辨 1j:術(shù)12周空白組三維成像，股骨髁骨洞處變淺，外口處可見明顯骨缺損，但外口已完全封閉 1k:術(shù)后12周α-CSH組三維重建圖像，股骨髁骨洞殘跡仍可見，外口處未封閉，可見內(nèi)部骨缺損 1l:術(shù)后12周α-CSH/NC組三維重建圖像，骨洞外口處完全閉合，無明顯骨缺損，股骨髁骨洞已難分辨

2.3 Micro-CT形態(tài)計量結(jié)果

術(shù)后12周Micro-CT掃描圖像采用CT自帶軟件對三組成骨情況進行分析［8］，測量結(jié)果見表1。α-CSH/NC組的骨小梁形態(tài)參數(shù)除骨小梁厚度外明顯優(yōu)于其他兩組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 Micro-CT骨形態(tài)計量結(jié)果（±s）與比較

表1 Micro-CT骨形態(tài)計量結(jié)果（±s）與比較

指標骨表面積（B S，m m 2）骨體積（B V，m m 3）骨體積分數(shù)（B V/T V，%）骨小梁數(shù)目（T b.N，1/m m）骨小梁厚度（T b.T h，μ m）骨小梁分離度（T b.S p，μ m）空白組（n=1 0）2 5 4 0.4 7±2 8.2 9 1 2 6.1 5±3.5 4 1 5.0 7±1.2 6 3.3 1±0.1 3 1 8 0.4 2±5.3 2 1 2 1.8 8±1 1.3 8 α-C S H 組（n=5）1 8 7 6.4 2±4 7.2 3 1 0 8.0 7±9.1 2 1 2.1 5±1.1 2 2.1 7±0.2 1 2 1 5.7 1±6.2 9 2 4 5.8 9±1 5.3 6 α-C S H/N C 組（n=5）3 2 2 4.2 9±3 4.3 5 2 2 1.7 2±8.3 9 2 5.7 7±2.0 3 4.7 9±0.2 8 1 9 9.7 8±3.8 6 6 4.5 9±5.2 7 P值<0.0 0 1<0.0 0 1<0.0 0 1<0.0 0 1<0.0 0 1<0.0 0 1

2.4 硬組織切片結(jié)果

硬組織切片如圖2所示，染色后骨小梁呈現(xiàn)粉紅色，術(shù)后4周時可見三組股骨髁骨洞處邊緣清晰，周緣處可見細小的新生骨小梁，除空白組考慮有少量殘留骨屑導(dǎo)致鉆孔中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)少量染色外其余組中央?yún)^(qū)域均未見明顯新骨生成，術(shù)后4周時α-CSH組已未見明顯殘留物，α-CSH/NC組中央?yún)^(qū)域仍可見明顯植入物；術(shù)后12周時可見兩組的植入物均完全吸收，三組骨洞周緣均有骨小梁長入，以α-CSH/NC組植骨骨洞處骨小梁最為密集，成果效應(yīng)最好，上述切片所得成骨情況同Micro-CT掃描結(jié)果基本一致。

圖2 兔股骨髁標本硬組織切片VG染色后圖像 2a:術(shù)后4周空白組切片染色圖像，可見骨洞邊界清楚，邊緣處骨小梁稀疏，中央處少量細小骨小梁，考慮為少量殘留骨屑 2b:術(shù)后4周α-CSH組切片染色圖像，骨洞周緣清晰，無明顯骨小梁長入，中央處可見少量植入物殘留 2c:術(shù)后4周α-CSH/NC組切片染色圖像，骨洞邊緣清晰，中央?yún)^(qū)域可見大塊殘留植入物，植入物吸收間隙未見明顯骨小梁長入 2d:術(shù)后12周空白組切片染色圖像，骨洞邊緣不清，骨小梁長入，中央?yún)^(qū)域可見稀疏骨小梁長入 2e:術(shù)后12周α-CSH組切片染色圖像，骨洞邊緣可見骨小梁長入，局部骨小梁聚集，較為致密，骨洞形態(tài)不規(guī)則，中央?yún)^(qū)域內(nèi)未見明顯骨小梁長入，骨缺損明顯 2f:術(shù)后12周α-CSH/NC組切片染色圖像，可見骨洞邊緣及中央處均有明顯骨小梁長入，中央骨缺損面積小，成骨效應(yīng)最佳

3 討論

良好的骨缺損修復(fù)材料不僅可以為骨缺損修復(fù)過程提供結(jié)構(gòu)和力學支撐，還應(yīng)能夠刺激相關(guān)成骨細胞的附著，增殖和分化。自1892年Dreesmann［1］首次報道應(yīng)用煅燒硫酸鈣修復(fù)骨缺損以來，硫酸鈣便以其優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性、可塑性及組織相容性等優(yōu)點在骨缺損及藥物緩釋等領(lǐng)域備受關(guān)注，硫酸鈣在骨缺損修復(fù)過程中除能夠提供一定程度的力學支撐外，其釋放的鈣離子還能夠促進成骨細胞的增殖和分化［2］，本實驗中α-CSH組雖然成骨效應(yīng)差，但α-CSH代謝過程中釋放大量鈣離子，可為成骨提供充足的原材料，這可能是導(dǎo)致α-CSH組骨洞周緣處局部骨小梁厚度優(yōu)于其他兩組的原因。但是α-CSH吸收速率過快，其降解速度明顯快于骨組織的再生速度，難以在骨再生的全過程中提供足夠的機械支撐，因此在其完全降解后骨缺損區(qū)域可能出現(xiàn)空隙，明顯削弱宿主骨的再生能力［9］。為降低α-CSH的代謝速率，本實驗借鑒以往研究中通過將α-CSH與殼聚糖、透明質(zhì)酸、聚乳酸、羧甲基纖維素等高分子聚合物復(fù)合，增強理化性質(zhì)的經(jīng)驗，將α-CSH同NC通過乳化分散的方式相復(fù)合，使NC在α-CSH中形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且其絲狀結(jié)構(gòu)同硫酸鈣晶體緊密結(jié)合，顯著增強結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，不僅增加其抗壓強度和韌性，而且可顯著增加硫酸鈣的抗?jié)⑸⑿裕?］，本實驗中術(shù)后4周α-CSH/NC組殘留物體積明顯優(yōu)于α-CSH組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步證明NC不僅能夠增強α-CSH的力學性能，而且能夠有效延緩α-CSH的代謝速率。

NC是木材、棉花、大麻等植物細胞壁的主要成分，同時也可以由特定的被囊動物、藻類、真菌和細菌合成，作為一種自然來源的天然高分子納米材料兼具天然纖維素和納米材料的特性［3，10］，具有良好的可降解性及生物相容性，是目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域重點研究的材料［4］。在本次實驗中α-CSH/NC組并沒有發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，周圍組織沒有壞死，進一步證實了NC良好的生物相容性。結(jié)果顯示它可以有效的模擬細胞外基質(zhì)環(huán)境，為細胞的附著及分化提供良好的環(huán)境［11］，而且NC是由D-吡喃式葡萄糖基通過β-(1→4)-D-糖苷鍵聯(lián)接而成的大分子，含有豐富的羧甲基等活性基團，能夠有效鰲合鈣離子，促進鈣磷酸鹽晶體均勻沉積,誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化［12］,其促成骨作用明顯優(yōu)于明膠等其他高分子化合物［13］，在骨缺損修復(fù)過程中，NC構(gòu)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)填充于整個骨洞中，α-CSH的包裹也進一步降低了NC的生物降解，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)起到一定生物支架的作用，誘導(dǎo)成骨細胞沿其纖維走行向骨洞中每個角落處附著，同時有效的鰲合α-CSH降解釋放的鈣離子，促進骨洞中央處骨小梁再生。

本研究通過動物實驗進一步驗證了α-CSH/NC復(fù)合植骨材料代謝速率低，生物相容性良好，骨缺損修復(fù)效應(yīng)顯著，未來將進一步對其進行改性研究，彌補其應(yīng)用缺陷，使其成為優(yōu)良的骨移植替代材料。