屈 蕓，朱 磊，胡 靜怡，左 武琪，沈 洪

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京，210023；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京，210029；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京，210029；4.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京，210028）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因未明的慢性非特異性胃腸道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液膿血便及不同程度的全身病變［1］。UC 典型的臨床表現(xiàn)除黏液膿血便或血性腹瀉、里急后重之外，可伴有乏力發(fā)熱、食欲減退等全身癥狀，病程多在6 周以上［2］。近20 年來，我國此病就診患者人數(shù)呈快速上升趨勢［3，4］。祖國醫(yī)學本無“潰瘍性結(jié)腸炎”之名，結(jié)合本病臨床表現(xiàn)，常歸屬中醫(yī)記載之“腸澼”、“久痢”、“泄瀉”范疇。臨床治療時，西醫(yī)多用傳統(tǒng)藥物（5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑）、生物制劑、營養(yǎng)支持治療與外科手術(shù)治療等［5］，但患者病情仍有反復且預后控制一般；中醫(yī)藥治療本病優(yōu)勢獨特，包括口服、灌腸及多種方式聯(lián)合治療，療效甚佳。清腸化濕方是岐黃學者—南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院沈洪教授臨床治療UC 驗方，本方經(jīng)國家“十一五”科技支撐計劃項目多中心、隨機、對照研究，治療UC 療效可靠［6］。清腸化濕方由黃芪、白芍、地榆、白頭翁、白芷、黃芩6 味藥物組成。UC 中醫(yī)病因多責之濕熱，二者壅滯腸道，氣血失調(diào)，傷及脂絡，最終成為膿血。清腸化濕方集“白頭翁湯”、“芍藥湯”、“黃芩湯”于一體，方中白頭翁清熱止痢、解毒涼血；白芍健脾柔肝、調(diào)氣和血；黃芩清腸化濕，止痢涼血；白芷排膿消腫；地榆斂瘡涼血；黃芪益氣健脾，共奏清熱除濕、調(diào)和氣血、止痢涼血之效。然本方成分復雜，治療UC 的作用機制尚不明確。因此，本文通過網(wǎng)絡藥理學，構(gòu)建“潛在活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡，探討其治療UC 的藥物關(guān)鍵成分及分子作用機制，以期為未來研究清腸化濕方治療UC 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和信號通路提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 潛在活性成分的篩選和作用靶點預測

應用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）［7］檢索清腸化濕方中的6 味中藥的化學成分，同時以類藥性（drug-likeness，DL）及生物利用度（oral bioavailability，OB）作為篩選指標，按照DL≥0.18，并且OB≥30%［8，9］的要求得出有效成分的化合物信息。 最 后 通 過 Uniprot（https：//www. uniprot.org/）［10］校正基因名。

1.2 UC 疾病靶點的選取

運用GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫進行UC 疾病靶點的選取，輸入“ulcerative colitis”進行檢索，得到相關(guān)靶點。應用R 軟件將得到的疾病靶點和之前篩選出的活性成分及潛在靶點進行比較，得到二者共同基因靶點并制作韋恩圖。

1.3 潛在活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡的構(gòu)建

應用Cytoscape3.7.1 軟件，將前述藥物潛在活性成分、共同基因的數(shù)據(jù)構(gòu)建“潛在活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建

在String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫［11］導入共同基因數(shù)據(jù)，選擇“Homo sapiens”物種，將medium confidence（0.4）設(shè)置為低相互作用分數(shù)，其余參數(shù)默認，導出PPI 網(wǎng)絡互作圖和TSV 文件。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

運用R 軟件3.6.3“clusterProfiler”軟件包對活性成分和疾病的共同靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.05，得到相應柱狀圖和通路圖。

2 結(jié)果

2.1 清腸化濕方潛在活性成分和作用靶點

應用TCMSP 檢索清腸化濕方中6 味中藥的化學成分，按照DL≥0.18，并且OB≥30% 的條件得出有效成分的化合物信息。其中黃芪20 個、白芍13個、地榆13 個、白頭翁11 個、白芷22 個、黃芩36 個，去重后共得到100 個化學成分。同時在TCMSP 平臺上獲取每個活性成分的潛在靶點1 409 個，去重后得到210 個。

2.2 UC 疾病基因

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，以“ulcerative colitis”為檢索詞，共找到4 213 個疾病基因，與清腸化濕方潛在活性成分的作用靶點比較，共有143 個共同基因。見圖1。

2.3 清腸化濕方活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖

應用Cytoscape3.7.1 軟件，將得到的活性成分-靶點關(guān)系進行導入，制作網(wǎng)絡圖，見圖2。圖2 中共包括212 個節(jié)點（67 個活性成分、143 個靶點、1 個疾病靶點、1 個復方節(jié)點）和721 條邊，有33 個活性成分未參與網(wǎng)絡構(gòu)建。圖2 中綠色代表靶點，淺藍色代表活性成分，深藍色代表復方，紅色代表疾病。其中Degree 值排名前4 位的活性成分是：槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）、黃芩素（baicalein）。Degree 值排名前4 的靶點是：一氧化氮合酶2（NOS2）、雌激素受體α（ESR1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Chk1（CHEK1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）。

圖1 QCHSD 與UC 的共同基因韋恩圖Fig 1 Venn diagram of common genes of QCHSD and UC

2.4 關(guān)鍵靶點互作圖

運用String 網(wǎng)站，將前述143 個共同靶點導入其中，得到相互作用圖，見圖3。在PPI 網(wǎng)絡圖中，共有143 個節(jié)點，2 758 條邊，平均節(jié)點度為38.6，圖中網(wǎng)絡節(jié)點代表基因蛋白，每個節(jié)點之間的線條代表蛋白之間的聯(lián)系，線條粗細代表蛋白互作關(guān)系的強弱。網(wǎng)絡節(jié)點顏色反應作用的不同證據(jù)類型。利用R 軟件計算各基因靶點Degree，同時制作核心靶點柱狀圖，見圖4。其中，前4 個靶點是：RAC-α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、白細胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）。

圖2 活性成分-作用靶點-疾病互作網(wǎng)絡Fig 2 Network diagram of component-target-disease

圖3 靶點蛋白-蛋白相互作用圖Fig 3 Protein-protein interaction（PPI）network of targets

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

運用R 軟件“clusterProfiler”對清腸化濕方與UC 的共同靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。在GO 功能富集分析圖中，X 軸和氣泡面積大小表示靶基因集中于GO 的數(shù)量，其中氣泡顏色代表P 值，富集顯著性；Y 軸表示GO 的名稱，可以看出靶基因主要明顯富集于核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等分子功能，對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、氧化應激反應等生物過程以及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細胞組分。見圖5 。

圖4 靶點互作關(guān)系barplot 圖Fig 4 Barplot diagram of interaction relationship between targets

在KEGG 通路富集分析圖中，X 軸代表靶基因集中在該通路上的數(shù)量，條形的顏色代表P 值，富集顯著性，Y 軸代表各通路名稱，可以看出靶點主要集中在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號通路、乙型肝炎、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、TNF 信號途徑等。見圖6。

圖5 分子功能GO 富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of molecular function

圖6 相關(guān)通路KEGG 富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis of related pathways

3 討論

目前認為，UC 有家族遺傳易感性的特點，同時環(huán)境、免疫、心理、飲食等因素互作發(fā)?。?2-14］。祖國醫(yī)學稱此病為“腸澼”、“久痢”等，認為其與脾、肝、肺、腎功能失調(diào)密切相關(guān)，沈洪教授認為脾為后天之本，可運化水濕；肝主疏泄，與情緒密切相關(guān)；肺與大腸相表里，肺金之勝，亦生腹鳴溏泄；久病及腎，此病具有反復發(fā)作、遷延難愈的特點，最終累及腎臟。UC 病因多與濕熱之邪相關(guān)，濕熱壅滯，傷及脂絡，最終成為膿血。清腸化濕方所含中藥集清熱除濕、調(diào)和氣血、止痢涼血功效于一體，治療UC 有堅實的理論基礎(chǔ)和良好的臨床療效。

筆者對清腸化濕方潛在活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡進行分析，方中關(guān)鍵化學成分主要為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、wogonin（漢黃芩素）、baicalein（黃芩素）等。槲皮素是膳食中抗氧化劑-黃酮類化合物的主要代表。Ju 等［15］實驗表明，槲皮素可以部分地通過血紅素加氧酶-1（H M O X 1，H O-1）依賴的途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞的抗炎和殺菌能力，從而改善實驗性結(jié)腸炎。表明槲皮素可能通過重新平衡腸巨噬細胞的促炎、抗炎和殺菌功能，恢復腸道宿主-微生物的正常關(guān)系，從而改善結(jié)腸炎。Chen 等［16］研究山奈酚改善了實驗性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短、脾臟腫脹的情況，改善了結(jié)腸絨毛、腺結(jié)構(gòu)和隱窩的結(jié)構(gòu)，并且抑制相關(guān)炎性細胞因子的活性，尤其是IL-1β 的表達；山奈酚還改變了結(jié)腸炎小鼠的腸道微生物結(jié)構(gòu)，表明異桿菌和類桿菌的數(shù)量顯著減少，乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加。通過提高機體抗氧化能力、減輕炎癥反應、調(diào)節(jié)腸道菌群等途徑，保護結(jié)腸免受右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的結(jié)腸炎的侵襲。此外，山奈酚可以通過抑制細胞增殖和侵襲，誘導細胞凋亡，其作用機制包括活性氧清除、免疫調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)控和DNA 甲基化、組蛋白脫乙酰等表觀遺傳修飾［17］。漢黃芩素在體外通過抑制巨噬細胞和上皮細胞的NF-κB 和ERK 信號通路來預防炎癥已被證實［18］。漢黃芩素可降低結(jié)腸和脾臟中CD4、CD25、CD127 和CD4 CD25Foxp 3 細胞的頻率，下調(diào)調(diào)節(jié)性T 細胞ERK 和STAT3-Y705 磷酸化，促進核因子-κB（NF-κB）和STAT3-S727 活化，并證明大劑量漢黃芩素治療可以通過刺激效應T 細胞和下調(diào)調(diào)節(jié)性T 細胞來增強免疫活性。在DSS 誘導的結(jié)腸炎模型中，黃芩素可減輕結(jié)腸炎的病情，黃芩素可促進結(jié)腸上皮細胞（CEC）的體外增殖。揭示黃芩素對JAK-STAT 信號通路中信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT3 和STAT4 的mRNA 表達下調(diào)，有助于其對T 細胞增殖的調(diào)節(jié)。然而，在DSS 模型中，作為腸道活化T 細胞靶細胞的CECs 中STAT4 的轉(zhuǎn)錄被黃芩素下調(diào)，提示黃芩素在自身免疫性疾病不同細胞類型中介導了相似的STAT 表達［19］。

活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡圖中Degree 值排名靠前的靶點是：一氧化氮合酶2（NOS2）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Chk1（CHEK1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG），這些靶點是治療UC 的關(guān)鍵。NOS2 又被稱為iNOS，在靜息狀態(tài)下不表達，在炎癥等病理狀態(tài)下大量產(chǎn)生，繼而產(chǎn)生大量NO，NO 可激活COX-2，參與COX-2 的致病過程。Song 等［20］試驗表明，潰瘍性結(jié)腸炎組織中iNOS 表達與組織炎癥程度有關(guān)，炎癥越重iNOS 表達越高。有研究表明［21］，在UC 相關(guān)異型增生和UC 相關(guān)腫瘤患者中，CHEK1 通過抑制JNK 的激活，促進細胞周期的進展，與DNA 損傷反應旁路聯(lián)系在一起。同時激活的CHEK1 可與染色質(zhì)結(jié)合，觸發(fā)了組蛋白乙?；约敖M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)的結(jié)合。PPARG 是一種核受體，在結(jié)腸上皮細胞中表達最高；體外研究表明，PPARG 可以通過限制髓樣細胞和上皮細胞分泌的趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生來抑制炎癥反應，在胃腸道的動態(tài)平衡方面起著重要作用。PPARG 可以抑制NF-κB 活性。UC 患者會出現(xiàn)結(jié)腸上皮細胞的PPARG 表達降低，腸黏膜中NF-κB 水平升高，表現(xiàn)為慢性腸道炎癥，使免疫系統(tǒng)與腸腔細菌維持動態(tài)平衡的能力受損［22］。

從String 平臺構(gòu)建的靶點互作圖中看出，AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3 等 是 重 要 靶 點。AKT1 是AKT 家族的一部分，可以調(diào)節(jié)細胞功能，包括細胞存活、增殖、分化、參與中間代謝等。有研究表明過表達的AKT1 促進了細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子（SOCS1）的激活，從而抑制了NF-κB 的磷酸 化、p65 的 磷 酸 化［23］。AKT1 是P13K 的 下 游 靶點，可以通過磷酸化下游底物來控制調(diào)節(jié)細胞功能，P13K-AKT 通路是經(jīng)典的細胞周期控制通路之一，在調(diào)節(jié)炎癥反應作用重大。IL-6 主要由活化的T 細胞分泌，作為促炎性細胞因子之一，主要參與炎癥免疫過程，在腸道疾病中，IL-6 與生物體的腸道菌群關(guān)系密切，其過表達會導致腸道發(fā)生炎性反應［24］。VEGFA 作為胱氨酸生長因子超家族一員，可以通過與RTKs 結(jié)合，進而激活其下游底物P13K產(chǎn)生生物學作用，參與一系列信號轉(zhuǎn)導過程。CASP3 屬于細胞中的凋亡基因之一，是整個凋亡級聯(lián)反應的重要調(diào)節(jié)點，能夠激活特定的信號通路，進而導致DNA 片段形成，促進凋亡。在生物體中，CASP3 與抑制因子共存，在腸道炎癌轉(zhuǎn)化過程中，會導致細胞凋亡和抗凋亡紊亂［25］。

通過GO 功能富集分析，可以看出清腸化濕方的活性成分主要通過核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體、細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性等重要靶點發(fā)揮作用。核受體是配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，其在細胞內(nèi)廣泛存在，主要包括激素類受體和孤兒核受體（Nur77）。它們在生物體的成熟發(fā)育，細胞增殖、分化、凋亡，腫瘤形成以及生理代謝等過程中起著基因調(diào)控的作用［26］。有研究表明，Nur77 在UC患者病變組織中的表達明顯低于正常組織，并且證實Nur77 可作為負性調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展［27］。細胞因子包括炎性因子、生長因子和趨化因子等。炎性反應增強是UC 患者病情變化的關(guān)鍵機制之一，炎癥介導的多種細胞通路活化，多種促炎因子IL-6、IL-8 等可以反應炎癥程度［28］。KEGG 通路富集分析表明，糖尿病并發(fā)癥AGERAGE 信號通路、乙型肝炎、IL-17 信號通路、TNF等信號途徑富集性較高。AGE 與RAGE 配體結(jié)合，通過激活氧自由基、蛋白激酶C、蛋白酪氨酸激酶、p38MAPK 和NF-κB 等影響信號傳導。有研究表明，在體外，IL-10 促進p38MAPK 磷酸化的核轉(zhuǎn)位，從而調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體-α、IL-10-受體-α 和橋粒芯糖蛋白-2 的表達。這些結(jié)果提示，p38MAPK介導的IL-10 與糖皮質(zhì)激素的協(xié)同作用改善了UC的橋粒直度，有助于腸上皮的恢復，減少了腸腔抗原與固有層的接觸［29］。IL-17 是促炎因子，在炎癥反應中發(fā)揮作用，有研究表明，通過抑制NF-κB 入核，調(diào)節(jié)Th17 細胞炎癥反應，抑制促炎因子IL-17等分泌，通過增加抑炎因子IL-10 分泌，可以減輕炎癥反應，同時增加UC 大鼠結(jié)腸MUC-2、ZO-1 的表達，修復腸黏膜緊密連接［30］。可以看出，清腸化濕方可能通過核受體、細胞因子等途徑以及AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 等通路起到抑制炎癥、促進凋亡的作用。

綜上所述，本研究通過運用網(wǎng)絡藥理學的方法，系統(tǒng)闡述了清腸化濕方治療UC 的作用機制，發(fā)現(xiàn)清腸化濕方治療UC 的可能潛在活性成分是槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素等，其關(guān)鍵基因是AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3 等，通過核受體、細胞因子等途徑以及AGE-RAGE 信號通路、IL-17信號通路、TNF 等通路起到抑制炎癥、促進凋亡的作用，從而達到治療UC 的作用。然而，本研究仍存在一定的局限性，在未來的研究中，應當通過具體實驗驗證預測的活性成分、關(guān)鍵靶點及通路，為清腸化濕方治療UC 提供有效的論證。