常 韋，李偉莉，陸莎莎

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥230031）

復(fù) 發(fā) 性 流 產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生3 次或3 次以上與同一性伴侶并于妊娠28 周前的胎兒丟失，其中包括非肉眼所見的妊娠［1］。但近年發(fā)現(xiàn)曾有過2 次自然流產(chǎn)史的患者，第3 次妊娠的流產(chǎn)率高達(dá)50%左右，故有學(xué)者認(rèn)為可將2 次流產(chǎn)史也歸為RSA［2］。RSA 病因十分復(fù)雜，包括染色體異常、解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、自身免疫異常、血栓前狀態(tài)、男方精液異常等多方面因素，同時與女性生活環(huán)境、心理壓力呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。臨床上有許多病人反復(fù)自然流產(chǎn)找不到具體病因［3］，對其家庭生活及心理帶來了較大的壓力。近年關(guān)于RSA 的研究及筆者前期研究均表明，母胎界面血管生成障礙與RSA 有著密不可分的聯(lián)系［4］。本院內(nèi)制劑補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA 患者保胎效果顯著。筆者前期研究證明補(bǔ)腎安胎沖劑可通過增加RSA 小鼠蛻膜組織的血管數(shù)量，同時提高其血管管壁的通透性來發(fā)揮保胎的功效［5］。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清對胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ras/MAPK 信號通路的影響，從分子層面探討補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞

標(biāo)本來自就診于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科的健康孕婦行人工流產(chǎn)術(shù)后的絨毛組織，孕齡為6～8 周。根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前將實(shí)驗(yàn)方案告知對方，并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

8 周 齡SPF 級 雄 性 大 鼠20 只，體 重 為（230±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物合格證號scxk（皖）2017-001，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)中心通風(fēng)干燥，溫度控制在22℃左右，相對濕度約為50%，每天采光與避光飼養(yǎng)各12 h，自由飲食及飲水。所有動物在正式給藥前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎安胎沖劑為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，組成藥物有：菟絲子、桑寄生、川斷、熟地、炒白術(shù)、白芍、黨參、炙黃芪、黃芩等，批號：皖藥制字BZ20080017。

1.4 主要試劑與儀器

DMEM（批 號：AE27369264），PBS（批 號：AE27429763），內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（廠家武漢原生原 代），雙 抗（批 號：20190530），percoll（貨 號：WX0181），RPMI1640 培養(yǎng)基（批號：AE24464298），MTT 檢測試劑盒（批號：BB18121），Transwell 小室（批號：28218051），基質(zhì)膠（批號：8113007），TGF-α（批號：31606），Salirasib（批號：5685），IGF-1（批號：331323），LY294002（批號：40419191010），RIPA 細(xì)胞裂解液（貨號：P0013B），SDS（批號：1029H032）、Glycine（批號：709R064）；PAGE 膠促凝 劑（批 號：1020F024）、Tris（批 號：1124Z071）、Tween-20（批號：505Q016）均購于Solarbio 公司；PVDF 膜（批號：R8KA7385）；山羊抗小鼠IgG（批號：142637）、山羊抗兔IgG（批號：136080）；β-Actin（批號：19AW0404）；Ras（批號：00022）；MAPK（批號：GR3215674-1）；Western 一抗二抗去除液（批號：051418180626），Trizol（批號：204403），DEPC-H2O（批 號：1803G26），Novostart SYBR qPCR Super-Mix Plus（批號：0512841），RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（批號：00691399），進(jìn)口羊血清工作液（批號：WK173310），PBS 緩沖液粉末（批號：18070201），熒光二抗（批號：AlexaFluor?488）-綠色（批 號：GR3203087-1），DAPI 染 色 液（批 號：071618190213），抗熒光淬滅封片液（批號：111318190306）。

移液槍（型號：KE0003087/KA0056573），離心機(jī)（型號：80-2），培養(yǎng)箱（型號：3111），倒置顯微鏡（型號：CKX31）；普通電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀均購于Tanon 公司；普通PCR 儀（批號：K960），低速迷你離心機(jī)（批號：LX 300），高速臺式冷凍離心機(jī)（批號：JW-3021HR），熒光定量PCR 儀（批號：PIKOREAL 96），微孔板迷你離心機(jī)（批號：MINI-P25），PIKO Plate Illuminator（批號：10212432C）。

1.5 方法

1.5.1 培養(yǎng)構(gòu)建胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞 將用生理鹽水沖洗過的絨毛組織置于滅菌離心管中，加入預(yù)冷的含青霉素與鏈霉素的PBS 緩沖液，浸泡30 min后置于加入了抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中，剔除掉結(jié)締組織，留取三級絨毛及末端，并將其剪碎。用配制好的含有0.1%的Ⅰ型膠原酶及0.2%分散酶的DMEM 培養(yǎng)基將組織碎片吸取到滅菌離心管中，37℃水浴，振蕩消化40 min。取混合液用滅菌的200 目濾膜過濾，收取濾膜上組織，用配制好的含0.02%Ⅰ型DNA 酶的0.25%的胰酶溶液吸取到另一個滅菌離心管中，37℃振蕩消化20 min 后加入5 mL 血清。所得混合液用200 目濾膜過濾，濾液置于4℃，1 000 r/min，離 心10 min，棄 上 清。 1 mL DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，沿管壁加入到25%、30%、35%的不連續(xù)percoll 梯度中，20℃400 r/min，離心20 min。收集白色絮狀層細(xì)胞，將其加入DMEM 培養(yǎng)基，4℃下1 000 r/min 離心5 min，棄上清。使用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到12孔板，靜置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后換液，以后每2～3 d 半量換液。培養(yǎng)的細(xì)胞單層融合至70%左右即可傳代，加入1 mL 胰酶37℃消化2 min，加入適量含血清培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打下來。4℃1 000 r/min 離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞沉淀接種到6 孔板，置于培養(yǎng)箱靜置后，將培養(yǎng)液置于另一培養(yǎng)孔中繼續(xù)培養(yǎng)，純化內(nèi)皮細(xì)胞。

1.5.2 藥物血清制備及篩選 補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清的制備：選擇正常健康SPF 級SD 大鼠20 只，隨機(jī)分為兩組分別為含藥血清組和空白組，含藥血清組予以補(bǔ)腎安胎沖劑灌胃，補(bǔ)腎安胎沖劑給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算后得出為11.7 g/kg，空白組予以等量的生理鹽水，每日給藥2 次，連續(xù)7 d，于末次給藥后1 h腹主動脈采血，操作過程嚴(yán)格無菌，3 000 r/min 離心15 min，分離得出血清。血清以56℃水浴滅活30 min，用0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌并組內(nèi)進(jìn)行混合，置-80℃保存以備體外實(shí)驗(yàn)使用。篩選：胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL，將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5% CO2、37℃孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察。加入不同濃度的含藥血清，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)后溶解結(jié)晶，在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD 值。

1.5.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 及篩選 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)血管內(nèi)皮生長因子受體2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2）在GenBank 中的序列設(shè)計(jì)合成3 對相應(yīng)的小干擾RNA（siRNA），和一對與大鼠基因無同源性的陰性對照組分為以下4 組：siRNA1 組、siRNA2 組、siRNA3 組、siRNA-NC 組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以期獲得對VEGFR2 抑制作用較明顯的siRNA，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行（具體引物序列見表1）。取對數(shù)生長期的胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞以2.5×105個/孔接種在6 孔板上，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至50% 左右開始轉(zhuǎn)染；取出siRNA 各組，0.50 D siRNA-NC 用62.5 μL 超純水溶解，10 D siRNA 組 用125 μL 超 純 水 溶 解 使 其 終 濃度為20 μmol/L；配置轉(zhuǎn)染試劑：取2 個無菌離心管，分別加入250 μL 無血清培養(yǎng)基，然后一管加入5 μL空載，另一管加入5 μL Lip2000，分別混勻靜置5 min 后再將兩管混勻，室溫放置20 min；其他各組同上；將混勻后的培養(yǎng)基（500 μL）加入到經(jīng)過無血清培養(yǎng)基洗滌3 次后的6 孔板中，輕輕搖晃2 min，放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 檢測轉(zhuǎn)染效率。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.5.4 分組及干預(yù)方法 取對數(shù)生長期的胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞以2.5×105個/孔接種于96 孔板，細(xì)胞生長至50%～60% 時，分為5 組：正常血清組、siRNA-NC 正常血清組、藥物血清組、siRNA 正常血清組、siRNA 藥物血清組。正常血清組加入正常大鼠血清培養(yǎng)；siRNA-NC 正常血清組轉(zhuǎn)染了siRNANC，加入正常血清；藥物血清組加入含20%補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清；siRNA 正常血清組轉(zhuǎn)染了siRNA，加入正常血清；siRNA 藥物血清組轉(zhuǎn)染SiRNA1，培養(yǎng)液中加入藥物血清，各組均培養(yǎng)24 h。

1.5.5 實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)檢測胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ras、MAPK mRNA 的相對表達(dá)量 各組血清干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，收集各組細(xì)胞沉淀，加入1 mL TRIzol 及0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4℃12 000 r/min 離心10 min，取上清液加入到另一EP 管中，加入0.5 mL 預(yù)冷的異丙醇，溫和混勻，冰上孵育30 min，離心15 min，棄去上清，加入1 mL 預(yù)冷的75℅乙醇漂洗2 次，待室溫干燥RNA 沉淀，加入20 μL DEPC 水，微量核酸儀檢測RNA 濃度。利用Primer-Script 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說明配制反應(yīng)體系，置于定量PCR 儀檢測mRNA 的相對表達(dá)水平。所用引物序列見表2。

表2 引物序列Tab 2 Primer sequence

1.5.6 Western blot 技術(shù)檢測胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ras、MAPK 蛋白的表達(dá) 各組血清干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，2 500 r/min，10 min，每106細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液1 mL（內(nèi)含1 mmol/L PMSF）后置于冰上進(jìn)行裂解30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清。按照1∶4 加入5× SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。水浴加熱10 min，待樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)。將濾紙和PVDF 膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中5 min。接通電源，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western 洗滌液中，漂洗后加入Western 封閉液，水平搖床室溫封閉2 h。參考一抗的說明書，分別按照合適的比例用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋，4℃緩慢搖動孵育過夜。 加入洗滌液（PBST），每次洗滌10 min，共洗滌3 次。參考二抗的說明書，按照1∶10 000 用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。室溫孵育2 h。加入洗滌液（PBST），每次洗滌10 min，共計(jì)3 次。參考相關(guān)說明書，使用ECL 發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。

1.5.7 免疫熒光技術(shù)檢測胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ras、MAPK 蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)好各組細(xì)胞后，吸除培養(yǎng)基，PBS 輕洗2×3 min，4% 多聚甲醛固定20 min，PBS 輕洗3×3 min；0.3% TritonX-100（PBS 配制）室溫通透20 min；除去TritonX-100，使用PBS 輕洗細(xì)胞；山羊血清37℃封閉30 min，按說明滴加一抗，37℃孵育60 min，使用PBS 輕洗除去一抗；滴加足夠量的二抗37℃避光孵育30 min，使用PBS 輕洗除去二抗；DAPI 復(fù)染細(xì)胞核避光5 min；使用PBS洗去多余的DAPI；將爬片取出，抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下觀察。根據(jù)熒光二抗的熒光顏色，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的綠光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清最佳作用濃度篩選

根據(jù)各組OD 值均值繪制如下曲線，可見補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清在20%濃度時達(dá)到最佳作用效果，后濃度繼續(xù)增加，作用效果不再增強(qiáng)。故本實(shí)驗(yàn)研究選用20%藥物濃度為后續(xù)藥物干預(yù)濃度。見圖1。

圖1 補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清治療濃度篩選折線圖Fig 1 Line diagram of treatment concentration screening of BSAT Granule containing drug serum

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 篩選結(jié)果

在各組內(nèi)參β-actin mRNA 的表達(dá)水平一致時，細(xì)胞正常對照組、siRNA-NC 組中的VEGFR2 mRNA 表達(dá)幾乎無變化（P=0.948），而siRNA1（P=0.000）、siRNA2（P=0.028）、siRNA3（P=0.01）表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中以siRNA1 組對VEGFR2 的沉默作用最為明顯。見表3。

表3 siRNA 篩選結(jié)果（±s）Tab 3 siRNA screening results（±s）

表3 siRNA 篩選結(jié)果（±s）Tab 3 siRNA screening results（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05,#P＜0.01。

組別正常組siRNA-NC siRNA1 siRNA2 siRNA3 mRNA 相對表達(dá)量1.02±0.16 0.98±0.16 0.36±0.03#0.52±0.07*0.48±0.08*25.288 0.00 n 6 6 6 6 6 HP

2.3 實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)檢測補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清對Ras、MAPK mRNA 表達(dá)水平的影響 正常 組 和 陰 性 對 照 組Ras（t=0.963，P=0.358）、MAPK（t=1.485，P=0.168）mRNA 的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）；藥物血清組細(xì)胞Ras（t=-6.085，P＜0.001）、MAPK（t=-6.913，P＜0.001）mRNA 的表達(dá)明顯高于正常血清組（P＜0.01）；siRNA1 正常血清組較正常血清組相比Ras（t=8.910，P＜0.001）、MAPK（t=7.109，P＜0.001）mRNA 的表達(dá)明顯下降（P＜0.01），表明siRNA1 對Ras、MAPK mRNA 的沉默效果十分明顯；siRNA1 藥物血清組與SiRNA1 正常血 清組Ras（t=6.475，P＜0.001）、MAPK（t=5.395，P＜0.001）mRNA 的表達(dá)相比有明顯差異（P＜0.01），表明補(bǔ)腎安胎沖劑可以上調(diào)VEGFR2 siRNA1 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 的Ras、MAPK mRNA的表達(dá)。見表4。

表4 RT-qPCR 技術(shù)檢測Ras、MAPK mRNA 表達(dá)水平（n=6，±s）Tab 4 Ras and MAPK mRNA expression levels detected by RT-qPCR（n=6，±s）

表4 RT-qPCR 技術(shù)檢測Ras、MAPK mRNA 表達(dá)水平（n=6，±s）Tab 4 Ras and MAPK mRNA expression levels detected by RT-qPCR（n=6，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與siRNA1 正常血清組比較，#P＜0.01。

MAPK 1.00±0.11 0.91±0.10 1.51±0.14*0.57±0.10*0.81±0.04#組別正常血清組siRNA-NC 正常血清組藥物血清組siRNA 正常血清組siRNA 藥物血清組Ras 1.00±0.17 0.93±0.09 1.58±0.15*0.36±0.05*0.63±0.09#

2.4 Western blot 技術(shù)檢測補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清對Ras、MAPK 蛋白表達(dá)水平的影響

正常組和陰性對照組Ras（t=-0.191，P=0.858）、MAPK（t=0.054，P=0.959）蛋白無明顯差異（P＞0.05）；藥 物 血 清 組Ras（t=-3.106，P=0.036）、MAPK（t=-2.905，P=0.044）蛋白的表達(dá)明顯高于正常血清組（P＜0.05）；siRNA1 正常血清組較正常血清組相比Ras（t=14.284，P＜0.001）、MAPK（t=9.589，P＜0.001）蛋白的表達(dá)明顯下降（P＜0.01），表明siRNA1 對VEGFR2 的沉默效果十分明顯；siRNA1 藥物血清組與siRNA1 正常血清組相比Ras（t=10.727，P＜0.001）、MAPK（t=10.854，P＜0.001）蛋白的表達(dá)有明顯差異（P＜0.01），表明補(bǔ)腎安胎沖劑可以上調(diào)轉(zhuǎn)染了VEGFR2 siRNA1 的內(nèi)皮細(xì)胞的Ras、MAPK 蛋白的表達(dá)。 見表5、圖2。

表5 Western blot 技術(shù)檢測Ras、MAPK 蛋白表達(dá)水平（n=6，±s）Tab 5 The expression levels of Ras and MAPK proteins detected by Western blot technology（n=6，±s）

表5 Western blot 技術(shù)檢測Ras、MAPK 蛋白表達(dá)水平（n=6，±s）Tab 5 The expression levels of Ras and MAPK proteins detected by Western blot technology（n=6，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01，△P＜0.05；與siRNA1 正常血清組比較，#P＜0.01。

MAPK 0.91±0.07 0.91±0.08a 1.06±0.06△0.51±0.02*0.76±0.04#組別正常血清組siRNA-NC 正常血清組藥物血清組siRNA 正常血清組siRNA 藥物血清組Ras 0.86±0.07 0.86±0.06a 0.97±0.01△0.29±0.02*0.64±0.05#

圖2 各組細(xì)胞Ras、MAPK 蛋白表達(dá)條帶Fig 2 Ras and MAPK protein expression bands in each group

2.5 免疫熒光技術(shù)檢測補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清對Ras、MAPK 蛋白表達(dá)水平的影響

正常組和陰性對照組Ras（t=0.221，P=0.829）、MAPK（t=0.371，P=0.726）蛋白無明顯差異（P＞0.05）；藥物血清組細(xì)胞Ras（t=-2.380，P=0.049）、MAPK（t=-2.247，P=0.048）蛋白的表達(dá)明顯高于正常血清組（P＜0.05）；siRNA1 正常血清組較正常血清組Ras（t=6.355，P＜0.001）、MAPK（t=7.144，P＜0.001）蛋白的表 達(dá) 明顯下降（P＜0.01），表明siRNA1 對VEGFR2 的沉默效果十分明顯；siRNA1 藥物血清組與siRNA1 正常血清組Ras（t=3.391，P=0.007）、MAPK（t=5.726，P＜0.001）相比有明顯差異（P＜0.01），表明補(bǔ)腎安胎沖劑可以上 調(diào)VEGFR2 siRNA1 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 的Ras、MAPK 蛋白的表達(dá)。見表6。胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，而陽性表達(dá)則為Ras、MAPK相對應(yīng)熒光素標(biāo)記的綠光，可見正常組和陰性對照組Ras、MAPK 的陽性表達(dá)無明顯差異；藥物血清組與siRNA1 正常血清組相比，Ras、MAPK 的陽性表達(dá)增強(qiáng)；siRNA1 藥物血清組與siRNA1 正常血清組相比，Ras、MAPK 陽性表達(dá)增強(qiáng)表明加入了補(bǔ)腎安胎沖劑藥物血清后相對應(yīng)的Ras、MAPK 蛋白表達(dá)明顯增多，在圖中表現(xiàn)為綠色標(biāo)記的熒光增強(qiáng)。見圖3。

表6 免疫熒光技術(shù)檢測Ras、MAPK 蛋白表達(dá)水平（n=6，±s）Tab 6 Ras and MAPK protein expression levels detected by immunofluorescence technology（n=6，±s）

表6 免疫熒光技術(shù)檢測Ras、MAPK 蛋白表達(dá)水平（n=6，±s）Tab 6 Ras and MAPK protein expression levels detected by immunofluorescence technology（n=6，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01，△P＜0.05；與siRNA1 正常血清組比較，#P＜0.01。

MAPK 0.84±0.08 0.86±0.11 0.93±0.03△0.48±0.08*0.71±0.04#組別正常血清組siRNA-NC 正常血清組藥物血清組siRNA 正常血清組siRNA 藥物血清組Ras 0.65±0.08 0.64±0.09 0.72±0.03△0.38±0.05*0.53±0.09#

圖3 各組細(xì)胞Ras、MAPK 蛋白表達(dá)熒光圖Fig 3 Fluorescent images of Ras and MAPK protein expression in each group

3 討論

RSA 為臨床妊娠較常見的并發(fā)癥，發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，嚴(yán)重影響患者甚至家庭成員的生活質(zhì)量。其病因復(fù)雜多樣，部分患者目前尚未發(fā)現(xiàn)具體原因，治療方案上也存在一些爭議［6］。目前RSA 的防治機(jī)制研究為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。有研究表明重鑄的母胎界面血管是維持妊娠的關(guān)鍵，其本質(zhì)是血管新生［7］。血管生成與多種調(diào)節(jié)因子有關(guān)，包括促血管生成因子和抑制因子［8-10］。因此如何改善RSA 患者母胎界面血管重鑄，將成為治療RSA 的重要途徑。筆者前期研究也表明補(bǔ)腎安胎沖劑能通過調(diào)控相關(guān)血管因子有效改善RSA 小鼠蛻膜血管生成，從而促進(jìn)母胎界面的血管形成，降低胚胎丟失率［11］。補(bǔ)腎安胎沖劑治療RSA 的作用機(jī)制可能是通過上調(diào)VEGF 信號通路下游的Ras、MAPK的 表 達(dá) 水 平［12-14］。Ras/MAPK 信 號 通 路 為VEGF下游的一個常見的信號通路，是細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的主要途徑，在胚胎的生長、細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要的 調(diào) 控 作 用［15，16］。在 補(bǔ) 腎 安 胎 沖 劑 上 調(diào)RSA 小 鼠Ras、MAPK 表達(dá)的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，本研究觀察其含藥血清對Ras、MAPK 表達(dá)的影響，以驗(yàn)證補(bǔ)腎安胎沖劑是否通過Ras/MAPK 信號通路影響母胎界面血管生成而發(fā)揮保胎作用。

Ras 家 族 包 括K-Ras，H-Ras，N-Ras 3 個 成 員，位于不同染色體上，由不同基因編碼。Ras 蛋白為細(xì)胞傳導(dǎo)通路的重要蛋白，參與了細(xì)胞的生長、分化過程［17］。在VEGF 信號通路下游，當(dāng)機(jī)體GTP取代GDP 并與Ras 結(jié)合后，Ras 蛋白處于一種活性狀態(tài)，調(diào)控機(jī)體細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和血管生成，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。一方面，在正常機(jī)體內(nèi)，Ras 與GTP 結(jié)合后一般處于較低水平，不至于導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，保證維持在正常水平；另一方面，Ras 又可與Raf 的N 端作用并使其激活，使得活化后的Raf 磷酸化MAPK 激酶（MAPKK）并相互結(jié)合，促使MAPKK 也發(fā)生活化，MAPKK 又反過來激活MAPK，二者相互作用。而MAPK 存在人體大部分的細(xì)胞內(nèi)，能使細(xì)胞外刺激信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，致使細(xì)胞增殖等現(xiàn)象發(fā)生?；罨腗APK 進(jìn)入細(xì)胞核，增加細(xì)胞裂解，使基因表達(dá)明顯增多，大量的轉(zhuǎn)錄因子活化，從而對血管生成等各方面產(chǎn)生影響［12］。本研究運(yùn)用不同方法檢測了胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ras、MAPK mRNA 及蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，正常組和陰性對照組Ras、MAPK 表達(dá)無明顯差異，從而排除siRNA 的內(nèi)源性干擾，保證本研究結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性；藥物血清組細(xì)胞Ras、MAPK 的含量明顯高于正常血清組，說明補(bǔ)腎安胎沖劑可上調(diào)胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ras、MAPK 的表達(dá)，這與筆者前期動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符合；siRNA1 正常血清組相對于正常血清組Ras、MAPK 的表達(dá)明顯下降，說明篩選后的siRNA1 對VEGFR2 的沉默效果顯著，可模擬RSA 患者VEGFR2 下降的一個狀態(tài)；與siRNA1 正常血清組相比，siRNA1 藥物血清組Ras、MAPK 含量明顯上升，轉(zhuǎn)染了VEGFR2 siRNA1 后其表達(dá)下降，加入了藥物血清后明顯上升，表明補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清可以上調(diào)轉(zhuǎn)染了siRNA1 的內(nèi)皮細(xì)胞Ras、MAPK 的表達(dá)。與血管生成相關(guān)的因子除了VEGF，還包括低氧誘導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)化生長因子等，本實(shí)驗(yàn)僅檢測了VEGF，后續(xù)研究可增加其他血管因子指標(biāo)的檢測，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度。

綜上所述，排除siRNA 等可能干擾的因素，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過補(bǔ)腎安胎沖劑含藥血清干預(yù)后的Ras、MAPK 含量均上升，說明補(bǔ)腎安胎沖劑可能是通過提 高Ras、MAPK 含 量 來 激 活Ras/MAPK 信 號 通路，從而促進(jìn)母胎界面血管生成，最終發(fā)揮其固腎養(yǎng)血安胎的作用。

作者貢獻(xiàn)度說明：

常韋：主要撰寫人，完成相關(guān)資料的收集和分析及論文初稿的寫作；李偉莉：項(xiàng)目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)論文寫作；陸莎莎：參與相關(guān)資料的分析、整理。全體作者都閱讀并同意最終的文本。