任 星，楊 靜，2，張菀桐，高 蕊

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京100091；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京100029）

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒感染導(dǎo)致的以潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)、各類(lèi)人群普遍易感為特點(diǎn)的傳染性疾?。?］。COVID-19 在臨床上主要表現(xiàn)為不明原因的發(fā)熱、咳嗽、氣促、呼吸困難及肺部感染癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、多器官衰竭甚至死亡，其主要傳播途徑為呼吸道傳播。隨著疾病的蔓延，全球多個(gè)國(guó)家及地區(qū)相繼出現(xiàn)確診病例［2，3］。目前治療上主要以抗病毒治療及對(duì)癥支持治療為主，尚無(wú)特效藥，對(duì)人類(lèi)健康、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)帶來(lái)巨大的不良影響。

COVID-19 屬 中 醫(yī)“疫 病”、“瘟 疫”范 疇［4］?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載：“五疫之至，皆相染易，無(wú)問(wèn)大小，病狀相似”，并將傳染性強(qiáng)、癥狀相似的一類(lèi)外感熱病稱(chēng)之為“疫病”［5］。中醫(yī)對(duì)于疫病的治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，針對(duì)病變過(guò)程中出現(xiàn)的熱（火）、寒、濕、毒、滯、結(jié)、瘀、燥、虛等病機(jī)變化，分別治以清解、散寒、化濕、解毒、祛痰、導(dǎo)滯、攻結(jié)、化瘀、潤(rùn)燥、補(bǔ)虛等法。COVID-19 發(fā)生于冬春季節(jié)，病邪多從口鼻而入，致肺失宣降、表氣郁閉等病機(jī)變化，符合清代醫(yī)家葉天士“溫邪上受，首先犯肺”和清代醫(yī)家吳鞠通“風(fēng)溫者，初春陽(yáng)氣始開(kāi)，厥陰行令，風(fēng)夾溫也”等認(rèn)識(shí)［6］。因此，衛(wèi)氣營(yíng)血辯證體系同樣適用于COVID-19 的辨證論治。針對(duì)病變過(guò)程中的病機(jī)變化，如邪犯肺衛(wèi)證，選用藥如金銀花、連翹等，主以疏表透邪，清宣肺熱［7］。近期的一些回顧性研究及病例報(bào)告提示中醫(yī)藥對(duì)于防治新冠肺炎可能具有積極作用。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)［8-10］表明連花清瘟膠囊治療COVID-19 有較好的臨床療效，且安全性較高。金銀花、連翹作為連花清瘟膠囊主要組成藥物，治療COVID-19 初期發(fā)熱、咳嗽、鼻塞、咽痛等邪犯肺衛(wèi)癥狀有良好的效果。金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的作用機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步探討。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為研究中藥單體及復(fù)方的作用及作用機(jī)制的新興學(xué)科，通過(guò)對(duì)藥物成分、作用靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)疾病等信息進(jìn)行數(shù)據(jù)整合及建模的方式進(jìn)行分析［11，12］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出金銀花、連翹中藥物成分及作用的靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)與金銀花-連翹藥對(duì)主要作用靶點(diǎn)相關(guān)的疾病，構(gòu)建靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行功能及通路富集分析。初步探索金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 獲取金銀花-連翹藥對(duì)藥物作用靶點(diǎn)

登錄TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索并獲取金銀花-連翹的藥物化學(xué)成分，以生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性≥0.18 為條件進(jìn)一步篩選金銀花和連翹的有效化合物。根據(jù)藥物已知成分，在TCMSP 及Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取成分作用靶點(diǎn)，將獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行去重處理，排除重復(fù)靶點(diǎn)。運(yùn)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)査詢(xún)靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)，得到金銀花-連翹藥對(duì)作用靶點(diǎn)并運(yùn)用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物成分-候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 獲取COVID-19 相關(guān)靶點(diǎn)

登錄GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，人類(lèi)基因?yàn)楸尘?，篩選數(shù)據(jù)庫(kù)中COVID-19 疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)，獲取疾病相關(guān)基因。

1.3 金銀花-連翹活性成分―COVID-19 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Funrich 軟件的韋恩圖功能，將藥物成分的候選靶點(diǎn)與COVID-19 疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)取交集，得到金銀花-連翹藥對(duì)有效成分治療COVID-19 的靶點(diǎn)，應(yīng)用Cytoscape 軟件構(gòu)建金銀花-連翹活性成分-COVID-19 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化分析。

1.4 生物進(jìn)程及KEGG 通路分析

將上述獲得的金銀花-連翹藥對(duì)有效成分治療COVID-19 的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行GO 生物學(xué)進(jìn)程及KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 金銀花-連翹藥對(duì)藥物化學(xué)成分篩選

登錄TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以金銀花、連翹為檢索詞，以生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性≥0.18 為條件篩選得到42 個(gè)化合物，篩選部分結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 金銀花-連翹藥對(duì)藥物候選靶點(diǎn)篩選

將上述獲得的42 個(gè)金銀花-連翹藥對(duì)活性成分引入TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得35個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)139 個(gè)作用靶點(diǎn)（其中有7 個(gè)活性成分的疾病靶點(diǎn)未被TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收錄）。將上述獲得的金銀花-連翹藥對(duì)作用靶點(diǎn)輸入到Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中査詢(xún)靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)，剔除非人源靶標(biāo)后最終得到金銀花-連翹藥對(duì)作用的疾病靶點(diǎn)135 個(gè)。并運(yùn)用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物活性成分候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如圖1。

該網(wǎng)絡(luò)共包含170 個(gè)節(jié)點(diǎn)，955 條邊。其中16個(gè)橘黃色節(jié)點(diǎn)代表金銀花活性成分，15 個(gè)黃色節(jié)點(diǎn)代表連翹活性成分，4 個(gè)紫色節(jié)點(diǎn)代表金銀花與連翹共有活性成分，135 個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表活性成分作用的靶點(diǎn)，955 條邊代表活性成分與靶點(diǎn)之間具有的相互作用關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)圖表明金銀花-連翹藥對(duì)中有多種藥物成分作用多個(gè)靶點(diǎn)，符合中藥多成分多靶點(diǎn)的特性。

表1 金銀花-連翹藥對(duì)部分活性成分一覽表Tab 1 The active ingredients of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

圖1 金銀花-連翹藥對(duì)活性成分候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of candidate targets of active ingredients of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

2.3 COVID-19 候選靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索，獲得COVID-19 相關(guān)基因靶點(diǎn)共259 個(gè)。

2.4 金銀花-連翹藥對(duì)成分―COVID-19 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Funrich 軟件的韋恩圖功能，將藥物成分的候選靶點(diǎn)與COVID-19 疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得金銀花-連翹藥對(duì)作用于COVID-19 疾病的26 個(gè)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

應(yīng)用Cytoscape 軟件構(gòu)建金銀花-連翹活性成分―COVID-19 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含52 個(gè)節(jié)點(diǎn)，262 條邊。其中26 個(gè)橘黃色節(jié)點(diǎn)代表金銀花-連翹藥對(duì)活性成分，形狀越大表示該成分的degree 值（在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的degree 值表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線(xiàn)的條數(shù)）越高；26 個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表金銀花-連翹藥對(duì)作用于COVID-19 的靶點(diǎn)（基因簡(jiǎn)稱(chēng)），并且形狀越大表示該靶點(diǎn)的degree 值越高。在化合物方面，由圖可見(jiàn)其中3 個(gè)化合物的degree值較大，分別是 MOL000006 木樨草素、MOL000422 山奈酚和MOL000098 槲皮素。說(shuō)明在金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的過(guò)程中，起主要作用的是木樨草素、山奈酚、槲皮素3 種活性成分。在藥物作用靶點(diǎn)方面，由圖可知PTGS2、DPP4、NOS2、PPARG、PTGS1、MAPK14 等 靶 點(diǎn)的degree 值較大，說(shuō)明金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的過(guò)程中主要作用于上述靶點(diǎn)。這體現(xiàn)了金銀花-連翹藥對(duì)多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。

圖2 金銀花-連翹藥對(duì)作用靶點(diǎn)和COVID-19 靶點(diǎn)韋恩圖Fig 2 Venn diagram of the drug pair Lonicera japonica-forsythia active and COVID?19 targets

2.5 金銀花-連翹藥對(duì)與COVID-19 相互關(guān)系的GO 生物進(jìn)程及KEGG 通路富集分析

將金銀花-連翹藥對(duì)作用于COVID-19 的26 個(gè)基因靶點(diǎn)通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 生物進(jìn)程及KEGG 通路富集分析，得到金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 相互關(guān)系的生物進(jìn)程及KEGG 通路結(jié)果。

2.5.1 生物進(jìn)程聚類(lèi)分析結(jié)果 通過(guò)GO 生物進(jìn)程分析，見(jiàn)圖4，可得知金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 可能主要是通過(guò)參與影響以下體內(nèi)生物進(jìn)程相關(guān)：（1）細(xì)胞凋亡過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of apoptotic process）；（2）基因表達(dá)的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）；（3）MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)（MAPK cascade）；（4）細(xì)胞對(duì)脂多糖（cellular response to lipopolysaccharide）等。由此可知，金銀花-連翹藥治療COVID-19 主要體現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)，誘發(fā)MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)等方面。

2.5.2 KEGG 聚類(lèi)分析結(jié)果 為進(jìn)一步探究金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的具體機(jī)制，運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行代謝通路分析，見(jiàn)圖5。由圖可知，金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的基因靶點(diǎn)主要富集在癌癥通路（pathways in cancer）、肺結(jié)核（tuberculosis）、甲型流感（influenza A）、乙型肝炎（hepatitis B）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）及缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）上。

圖4 金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的GO 生物進(jìn)程聚類(lèi)分析結(jié)果Fig 4 Cluster analysis results of GO biological process in the treatment of COVID?19 of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

圖5 金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的KEGG 通路聚類(lèi)分析結(jié)果Fig 5 Cluster analysis results of KEGG pathway in the treatment of COVID?19 of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

3 討論

COVID-19 不僅具有廣泛的流行性而且人群普遍易感，與《素問(wèn)·刺法論篇》記載的“五疫之至，皆相染易，無(wú)問(wèn)大小，病狀相似”及明代醫(yī)家吳又可《溫疫論》中記載的“無(wú)問(wèn)老少?gòu)?qiáng)弱，觸之者即病”等論述相符。因此，COVID-19 可歸于中醫(yī)“疫病”的范疇［7］。中醫(yī)藥防治流感不僅可以通過(guò)調(diào)整機(jī)體免疫力從而達(dá)到防病的目的，也能夠直接作用于病毒本身，具有療效好、副作用少、作用范圍廣的特點(diǎn)［13］。該病初期多見(jiàn)發(fā)熱、惡寒、咳嗽、乏力、脈數(shù)等癥狀，在衛(wèi)氣營(yíng)血辯證中屬邪犯肺衛(wèi)證，多用銀翹散治療。金銀花、連翹為銀翹散君藥，具有疏表透邪，清宣肺熱的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花、連翹亦有抗流感病毒的效果。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，通過(guò)分析金銀花-連翹藥對(duì)與COVID-19 分子網(wǎng)絡(luò)在生物功能方面的異同，初步探索金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 邪犯肺衛(wèi)證的作用機(jī)制。金銀花-連翹藥對(duì)成分―COVID-19 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，金銀花-連翹藥對(duì)在治療COVID-19 的過(guò)程中，作用最強(qiáng)的化合物是槲皮素、山奈酚和木犀草素。近年來(lái)，對(duì)槲皮素藥理作用的研究表明，其具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［14］。萬(wàn)巧鳳等［15］研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制感染細(xì)胞Casepase-3 蛋白表達(dá)，拮抗病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗甲型H1N1 流感病毒的作用。槲皮素可抑制多種病毒對(duì)細(xì)胞的感染，并且能夠抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［16］?，F(xiàn)代藥理研究表明，山奈酚具有抗炎、抗菌、抗病毒以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理作用［17］。李妍等［18］研究表明，山奈酚通過(guò)下調(diào)NF-κB 信號(hào)通路的表達(dá)降低甲型H9N2 流感病毒所致急性肺損傷小鼠的炎癥程度和氧化應(yīng)激損傷，最終減輕流感病毒所致的急性肺損傷。木犀草素具有抗柯薩奇病毒、抗菌、抑制組織纖維化、免疫調(diào)節(jié)等作用［19］。鄧東沅等［20］研究表明在體外環(huán)境下，流感病毒H1N1 感染A549 細(xì)胞激活凋亡通路后，木犀草素能通過(guò)降低相關(guān)基因表達(dá)，干預(yù)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制流感病毒的作用。綜上，金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的主要活性成分具有抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)的作用，說(shuō)明金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，并具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

通過(guò)GO 生物進(jìn)程聚類(lèi)分析，可得知金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的基因主要富集在細(xì)胞凋亡過(guò)程的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程中，提示金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 主要體現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)、誘發(fā)MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)等方面。KEGG 通路富集結(jié)果涉及癌癥通路、肺結(jié)核、甲型流感、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號(hào)通路及缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路等，提示金銀花-連翹藥對(duì)可能通過(guò)這些通路起到治療COVID-19 的作用。冠狀病毒感染細(xì)胞后，為了在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配下一代，病毒在應(yīng)對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的同時(shí)，還參與到許多其他細(xì)胞活動(dòng)中。當(dāng)細(xì)胞特定受體與病毒蛋白結(jié)合后，細(xì)胞立即啟動(dòng)凋亡程序。通過(guò)表達(dá)靶向蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制病毒的復(fù)制，可達(dá)到控制病毒的感染和傳播的目的［21］。MAPK 家族作為一種重要的信號(hào)調(diào)節(jié)酶，連接細(xì)胞膜表面受體，調(diào)節(jié)決定性基因的表達(dá)，控制細(xì)胞適應(yīng)、增殖、分化、存活和程序性細(xì)胞死亡等生理過(guò)程［22］。相關(guān)研究表明，TNF 信號(hào)通路主要作用于COVID-19 患者在免疫反應(yīng)和炎癥風(fēng)暴中被激活的細(xì)胞因子，抑制活化的細(xì)胞因子，緩和免疫反應(yīng)，消除炎癥［23］。HIF-1 信號(hào)通路在抗病毒、介導(dǎo)能量代謝、炎癥反應(yīng)、血管生成以及維持干細(xì)胞特性等方面發(fā)揮重要作用［24］。

綜上所述，金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的作用機(jī)制主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)，抑制病毒復(fù)制，控制病毒的感染和傳播；誘發(fā)MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制病毒細(xì)胞增殖、分化，減緩COVID-19發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程。作用于肺結(jié)核、甲型流感、乙型肝炎、腫瘤壞死因子及缺氧誘導(dǎo)因子等通路上，起到抗病毒、抑菌退熱、免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度闡述了金銀花-連翹藥對(duì)治療COVID-19 的作用機(jī)制，鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身的局限性，后期應(yīng)對(duì)主要活性成分和相關(guān)通路靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，為臨床相關(guān)治療提供理論基礎(chǔ)和有效證據(jù)。