成余勤，石森林，來平凡

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

當(dāng)歸芍藥散最早見于漢代張仲景所著《金匱要略》，具有養(yǎng)血疏肝、健脾利濕的功效，古人用于治療“婦人雜病腹中諸疾痛”[1]。現(xiàn)代中醫(yī)常以此方為基礎(chǔ)治療原發(fā)性痛經(jīng)，具有良好的效果[2-3]。方中用當(dāng)歸活血養(yǎng)血，川芎行氣補(bǔ)血，白芍?jǐn)筷幯a(bǔ)血兼止腹痛，三藥伍之共奏補(bǔ)血養(yǎng)肝之效，為主藥；白術(shù)味苦而甘，健脾燥濕安胎；茯苓滲濕健脾寧心，澤瀉淡慘利濕消腫，二藥共協(xié)白術(shù)健脾去濕。茯苓、白術(shù)、澤瀉逐水氣利小便，針對(duì)的是婦人懷妊，腹中疞痛的情況，因此加減當(dāng)歸芍藥散（modified Danggui Shaoyao San，MDSS）在原方的基礎(chǔ)上，減去白術(shù)、茯苓和澤瀉，加入延胡索、香附和吳茱萸，使其著重于治療原發(fā)性痛經(jīng)，方中延胡索活血、行氣、止痛，香附疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛，吳茱萸散寒止痛。同時(shí)，現(xiàn)代研究表明延胡索中的延胡索乙素可通過抑制子宮收縮起直接鎮(zhèn)痛作用[4]，香附中的α-香附酮已被證明為鎮(zhèn)痛和抗子宮痙攣的活性化合物[5-6]，吳茱萸中的吳茱萸堿可舒張子宮平滑肌，恢復(fù)產(chǎn)熱機(jī)能，達(dá)到活血止痛的目的[7-8]，前期研究表明MDSS對(duì)痛經(jīng)模型小鼠確有療效。

當(dāng)歸揮發(fā)油中的主要成分藁本內(nèi)酯[9]，具有鎮(zhèn)痛[10]、抗癌、抗炎、抗氧化等藥理作用[11]；川芎揮發(fā)油的主要成分藁本內(nèi)酯和丁基苯肽[12]具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、改善血流變、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗炎、降壓等多種藥理作用[13]；香附揮發(fā)油的主要成分香附酮和香附烯[14]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[15]。在形成制劑時(shí)，揮發(fā)油的傳統(tǒng)加入方式為噴入，在揮發(fā)油得率原本就不高的情況下由于揮發(fā)油易揮發(fā)的特性，進(jìn)一步增加了揮發(fā)油的損失。MDSS揮發(fā)油其中1個(gè)主要藥效成分藁本內(nèi)酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)存在多個(gè)雙鍵構(gòu)成的高度不飽和共軛體系，此結(jié)構(gòu)特性決定其穩(wěn)定性較差，在提取、分離、純化和貯存過程中均極易發(fā)生氧化、聚合等降解反應(yīng)[16-17]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)階段常用的β-環(huán)糊精包合技術(shù)固化揮發(fā)油[18-19]，以增加揮發(fā)油的穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

川芎（產(chǎn)地為四川，批號(hào)200601）、醋香附（產(chǎn)地為浙江，批號(hào)200601）、當(dāng)歸（產(chǎn)地為甘肅，批號(hào)200701），浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司；所有飲片均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)來平凡教授鑒定，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，香附為莎草科莎草屬植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根。硅膠板，青島海洋化工廠分廠；β-環(huán)糊精，批號(hào)Z30M10Y89545，上海源葉生物科技有限公司；正己烷，批號(hào)20120703，杭州石化有限責(zé)任公司；醋酸乙酯，批號(hào)20200902，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet IS50紅外分光光度計(jì)，美國賽默飛世爾科技有限公司；ZF-I型三用紫外分析儀，上海顧村電光儀器廠；S-3000N E-1010掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司；XRD-6100 X射線衍射儀，日本島津公司；CP313電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；XS105分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DFY-500高速萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；DNG-5070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究，確定揮發(fā)油提取工藝為按10倍處方量稱取川芎75 g，當(dāng)歸45 g，香附60 g，加入9倍藥材用量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及中藥飲片用量1.0%的果膠酶，在46 ℃下酶解30 min后，水蒸氣蒸餾法提取4 h，得到1.238 g MDSS總揮發(fā)油。

2.2 空白回收率、包合率、得率的測定

2.2.1 揮發(fā)油空白回收率測定 稱取總揮發(fā)油約0.5 g，精密稱定，共計(jì)3份，分別置500 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300 mL連接揮發(fā)油提取器，提取揮發(fā)油4 h，計(jì)算揮發(fā)油提取平均空白回收率為73.21%，RSD為1.42%。

2.2.2 揮發(fā)油包合率測定 稱取適量包合物約3 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入300 mL水，按“2.2.1”項(xiàng)下提取揮發(fā)油并測定揮發(fā)油質(zhì)量，計(jì)算包合率。

揮發(fā)油包合率＝包合物中提取揮發(fā)油量/(空白回收率×加入揮發(fā)油量)

2.2.3 包合物得率測定 包合物制備完成后計(jì)算其得率。

包合物得率＝包合物實(shí)際質(zhì)量/(β-環(huán)糊精質(zhì)量＋揮發(fā)油質(zhì)量)

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)因素、水平確定 飽和水溶液法包合揮發(fā)油一般受β-環(huán)糊精用量、包合溫度、包合時(shí)間等因素的影響，通過參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用正交試驗(yàn)法，以揮發(fā)油包合率為考察指標(biāo)，β-環(huán)糊精用量與揮發(fā)油比例（A）、包合溫度（B）、包合時(shí)間（C）為考察因素[18-21]，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，利用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。其因素水平安排見表1。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以包合率、包合物得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中包合率作為主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為0.604 6，包合物得率作為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為0.395 4，按“2.3.3”項(xiàng)下計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental design and results of orthogonal test

2.3.3 信息熵法確定權(quán)重系數(shù) 信息熵是系統(tǒng)不確定性和無序程度的度量，除了度量數(shù)據(jù)包含的信息量，還可用于在多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中用來確定各指標(biāo)權(quán)重。該法是將每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)作為1個(gè)隨機(jī)變量，計(jì)算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其取值變異程度越大，越無序，提供的信息量越多，該指標(biāo)就越重要；反之該指標(biāo)就越不重要。用熵權(quán)法確定權(quán)重的計(jì)算步驟如下。

（1）原始數(shù)據(jù)矩陣歸一化，建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣：現(xiàn)有m個(gè)待評(píng)項(xiàng)目，n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，形成原始數(shù)據(jù)矩陣R＝(rij)m×n，其中rij為第j個(gè)指標(biāo)下第i個(gè)項(xiàng)目的評(píng)價(jià)值，即建立正交中9次試驗(yàn)的包合物得率和揮發(fā)油包合率矩陣。

（2）將原始數(shù)據(jù)矩陣(Rij)m×n轉(zhuǎn)化為概率矩陣(Pij)m×n，在信息熵公式中Pij為某個(gè)信息的概率，滿足0≤Pij≤1，因此必須先對(duì)矩陣(Rij)m×n做歸一化處理，經(jīng)處理后的矩陣可視為評(píng)價(jià)指標(biāo)的概率矩陣，其中Pij表示第j個(gè)指標(biāo)下第i個(gè)項(xiàng)目的概率。

（3）計(jì)算指標(biāo)的熵值，確定第j個(gè)指標(biāo)的信息熵（Hj）。包合物得率及包合率的信息熵分別為0.720 8和0.573 1。

當(dāng)Pij＝0時(shí)，考慮到lnPij無意義，因此，對(duì)Pij的計(jì)算進(jìn)行修正，將其定義為

（4）計(jì)算指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)（Wj）。包合物得率及包合率的熵權(quán)系數(shù)分別為0.395 4、0.604 6。

（5）綜合評(píng)分（Y）的計(jì)算。

Y＝包合物得率/包合物得率最大值×100×0.395 4＋揮發(fā)油得率/揮發(fā)油包合率最大值×100×0.604 6

2.3.4 結(jié)果分析 由表2可知，各因素影響程度依次為C＞A＞B，因素A、B、C均對(duì)包合效果有顯著影響（P＜0.05）。因此，確定最優(yōu)包合工藝為A2B2C3，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1∶10，包合溫度40 ℃，攪拌時(shí)間2 h。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 由于正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)包合工藝條件中包合時(shí)間2.0 h為最高水平，因此對(duì)包合時(shí)間進(jìn)行了考察。試驗(yàn)結(jié)果見表3，包合2.5 h時(shí)，包合物得率及揮發(fā)油包合率分別為65.23%、79.16%，包合3.0 h時(shí)，包合物得率及揮發(fā)油包合率分別為65.67%、80.86%。由結(jié)果可知，包合時(shí)間為3.0 h時(shí)，包合效果最好，但包合物得率及揮發(fā)油包合率增幅均較小，考慮到時(shí)間及資源成本，決定包合時(shí)間仍為2.0 h。

表3 包合時(shí)間對(duì)環(huán)糊精包合的影響 (±s,n=3)Table 3 Effect of inclusion time on cyclodextrin inclusion(±s ,n=3)

表3 包合時(shí)間對(duì)環(huán)糊精包合的影響 (±s,n=3)Table 3 Effect of inclusion time on cyclodextrin inclusion(±s ,n=3)

包合時(shí)間/h 包合物得率/% 包合率/%2.0 64.56±0.76 80.44±0.64 2.5 65.23±0.08 79.16±0.40 3.0 65.67±1.03 80.86±0.71

按“2.3.4”項(xiàng)下確定的最優(yōu)工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，即稱取5 g β-環(huán)糊精置于100 mL具塞錐形瓶中，加入90 mL純化水，置于恒溫磁力攪拌器上50 ℃加熱溶解，待溶解完畢，將溫度降至40 ℃，緩慢滴加揮發(fā)油的95%乙醇（1∶1）溶液，繼續(xù)恒溫?cái)嚢? h，取出，置于冰箱中冷藏24 h，快速抽濾，5 mL 95%乙醇洗滌3次后40 ℃干燥5 h。試驗(yàn)結(jié)果見表4，包合物的平均得率為64.56%，包合率為80.44%，綜合評(píng)分為95.94。表明該包合工藝穩(wěn)定，可用于MDSS揮發(fā)油包合物的制備。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification test

2.4 包合物表征

2.4.1 外觀性狀 分別取揮發(fā)油包合物、揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物、β-環(huán)糊精置于干凈的濾紙上，比較3者之間的區(qū)別。在第0天時(shí)，3者均為白色粉末狀物質(zhì)、β-環(huán)糊精比包合物及物理混合物粉質(zhì)細(xì)膩，如圖1所示；物理混合物有揮發(fā)油氣味，包合物及β-環(huán)糊精則無揮發(fā)油氣味。在第10、20天時(shí)，物理混合物變成淡黃色，可能的原因是揮發(fā)油不穩(wěn)定，氧化或降解造成顏色加深形成淡黃色物理混合物，包合物及β-環(huán)糊精則仍為白色粉末狀?？沙醪酱_定揮發(fā)油包合物已形成，且揮發(fā)油包合后較未包合穩(wěn)定。

圖1 揮發(fā)油包合物、揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物、β-環(huán)糊精在不同時(shí)間點(diǎn)的外觀性狀Fig.1 Appearance of volatile oil β-CD inclusion complex,mixture of volatile oil and β-CD,and β-CD at different time points

2.4.2 TLC分析 分別稱取β-環(huán)糊精、包合物、物理混合物0.1 g，揮發(fā)油10 μL，加入1 mL甲醇，振搖后取上清。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖2。解包后包合物及物理混合物斑點(diǎn)與揮發(fā)油一致，β-環(huán)糊精無相應(yīng)斑點(diǎn)，表明揮發(fā)油包入β-環(huán)糊精空腔后主要成分無差異。

圖2 樣品TLC色譜Fig.2 TLC of samples

2.4.3 紫外光譜分析 稱取適量的β-環(huán)糊精、物理混合物、包合物及少量揮發(fā)油，溶于甲醇中。β-環(huán)糊精、物理混合物、包合物超聲提取30 min，取上清。將以上4種樣品在200～800 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖3。β-環(huán)糊精的曲線平緩，僅在接近200 nm處有吸收。包合物超聲提取揮發(fā)油后，紫外吸收光譜與揮發(fā)油及物理混合物相似，表明包合前后，揮發(fā)油未發(fā)生改變。

圖3 紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum

2.4.4 紅外光譜分析 取揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、物理混合物、包合物適量，在波數(shù)4000～500 cm?1進(jìn)行紅外特征測定，結(jié)果見圖4。由圖4可知，包合后2 927.39、1 762.16 cm?1等處的揮發(fā)油吸收峰已經(jīng)消失或明顯減弱，而在物理混合物中仍然存在，表明揮發(fā)油進(jìn)入β-環(huán)糊精空腔，其紅外振動(dòng)受到限制。包合物特征峰與β-環(huán)糊精相似，峰形相同，物理混合物整體紅外吸收特征與β-環(huán)糊精相似，在物理混合物中1 765.20、1 663.09 cm?1處的吸收峰為揮發(fā)油的特征峰，表明其紅外圖譜是由吸收較強(qiáng)的β-環(huán)糊精紅外圖譜與吸收較弱的揮發(fā)油紅外圖譜加和而成的。

圖4 樣品紅外光譜Fig.4 Infrared spectrum of samples

2.4.5 X射線衍射分析 測試條件為Cu靶（40 kV，40 mA）；步進(jìn)掃描0.02°/步；掃描范圍10°～80°；掃描速度2°/min。分別對(duì)β-環(huán)糊精粉末、揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物（1∶10）和β-環(huán)糊精包合物3組樣品進(jìn)行XRD分析。結(jié)果見圖5，β-環(huán)糊精在10°～35°有多個(gè)強(qiáng)的結(jié)晶特征衍射峰，且物理混合物的特征衍射峰與β-環(huán)糊精基本一致，說明β-環(huán)糊精仍以原晶體形式存在于物理混合物中。而在包合物中，衍射峰數(shù)量明顯減少，部分衍射峰加強(qiáng)或生成，與前兩者有顯著性差別。說明環(huán)糊精包合揮發(fā)油后，晶型發(fā)生顯著性改變，表明揮發(fā)油已包合在β-環(huán)糊精空穴中。

圖5 樣品X射線衍射圖Fig.5 XRD of samples

2.4.6 SEM觀察 稱取一定量的β-環(huán)糊精、物理混合物和包合物置于蓋玻片上，在其表面真空鍍金后固定于銅板上，再通過SEM觀察各樣品的表面和晶體結(jié)構(gòu)。由圖6可知，β-環(huán)糊精及物理混合物均為不規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，表面粗糙，凹凸不平，物理混合物與包合物相比小顆粒較少，多為團(tuán)塊狀，這可能是因?yàn)閾]發(fā)油黏度較大，與β-環(huán)糊精物理混合之后，將環(huán)糊精聚集在一起形成團(tuán)塊狀。包合物則多為小顆粒狀，表面光滑，與β-環(huán)糊精相比，形態(tài)和晶型發(fā)生了重大變化，表明包合物已形成。

圖6 樣品掃描電鏡圖Fig.6 SEM of samples

3 討論

當(dāng)歸芍藥散為張仲景調(diào)理肝脾的代表方劑，臨床上多采用其加減方治療原發(fā)性痛經(jīng)[22]，對(duì)其進(jìn)行加減后可使其治療原發(fā)性痛經(jīng)療效更為確切。MDSS中當(dāng)歸、川芎、香附揮發(fā)油含量較高且已有相關(guān)研究表明揮發(fā)油對(duì)痛經(jīng)具有明顯藥效[10,13,15]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)MDSS揮發(fā)油中含有藁本內(nèi)酯，其是一種極不穩(wěn)定的化合物，因此需對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合，以增加其穩(wěn)定性，便于儲(chǔ)存。目前，揮發(fā)油常用β-環(huán)糊精包合，包合方法有飽和水溶液法、研磨法以及超聲法，已有研究表明飽和水溶液法制備包合物的得率及包合率均顯著高于另外2種[20,23]，且制備工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)以包合物得率及揮發(fā)油包合率為指標(biāo)，運(yùn)用熵權(quán)法結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化揮發(fā)油包合工藝。熵權(quán)法確定評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重可以避免主觀因素的影響，從而得出較為客觀的指標(biāo)權(quán)重。由于包合因素及水平的確定是參考文獻(xiàn)，因此正交試驗(yàn)確定的工藝包合時(shí)間2.0 h不夠科學(xué)和準(zhǔn)確，可能存在包合時(shí)間大于2.0 h時(shí)，包合效果更好的情況。因此后續(xù)對(duì)包合時(shí)間進(jìn)行了考察，分別考察了包合2.5 h及3.0 h時(shí)包合物得率及包合率，最終決定選擇包合時(shí)間為2.0 h。本研究通過對(duì)用飽和水溶液法制備包合物進(jìn)行研究，得到制備工藝簡單，所需儀器設(shè)備較少的方法，故適合工業(yè)化大生產(chǎn)。該方法穩(wěn)定、可行，為后續(xù)研究及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突