周麗娟 楊 樸 鄭道都 孫勁璞（商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，商丘 476000）

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤疾病，近些年的發(fā)病率持續(xù)增高且患病人群逐漸呈現(xiàn)年輕化特征［1］。腦膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲性特別強(qiáng)，會透過血管壁及膠質(zhì)細(xì)胞間的連接來浸潤壓迫并破壞腦組織［2］。腦膠質(zhì)的手術(shù)難點(diǎn)在于其常與正常腦組織分界不清，導(dǎo)致手術(shù)切除不徹底，同時(shí)術(shù)后又極易復(fù)發(fā)［3］。目前針對腦膠質(zhì)瘤的治療依舊是個(gè)醫(yī)學(xué)難題，又因其對放療和化療不敏感，所以針對腦膠質(zhì)瘤的藥物研究成為熱點(diǎn)。腦膠質(zhì)瘤往往會對正常腦神經(jīng)產(chǎn)生壓迫，導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞暫時(shí)的缺血和缺氧從而誘導(dǎo)腦神經(jīng)死亡［4-7］，因此在針對腦膠質(zhì)瘤的藥物治療過程中，如果對缺血性腦卒中具有一定的保護(hù)作用，這將非常有利于患者的治療和康復(fù)。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥的治療方案，本研究發(fā)現(xiàn)秋水仙素具有對腦膠質(zhì)瘤和缺血性腦卒中治療的潛力。秋水仙素是萃取于百合科植物秋水仙的種子和球莖的一種植物堿，白色或淡黃色的粉末或針狀晶體。最先用于治療風(fēng)濕病和痛風(fēng)，但已有研究報(bào)道其對腫瘤具有一定的治療效果。

因此本研究以U87細(xì)胞和HT22細(xì)胞為研究對象，探討不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和海馬神經(jīng)元細(xì)胞的抑制和保護(hù)作用，為秋水仙素在臨床上治療腦膠質(zhì)瘤和缺血性腦卒中提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 秋水仙素購自河南省食品藥品檢驗(yàn)所；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自美國HyClone公司；蛋白酶抑制劑購自Roche美國公司；青鏈霉素混合液購自北京Solarbio公司；βactin、Caspase-3、Bcl-2、Cyclin-D1、Bax和p53以及PIK3/AKT抗體、兔二抗購自英國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Advansta公司；CCK-8試劑盒和ROS檢測試劑盒購自河南瑞祥生物公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自北京碧云天。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔鋪板，隨后分別加入不同濃度的秋水仙素（0、10、20、30、40 ng/ml），以正常培養(yǎng)細(xì)胞為空白對照組，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～60 h。結(jié)束后每孔加入20μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀450 nm檢測細(xì)胞CCK-8混合液OD值進(jìn)行活力分析。

1.2.2 qRT-PCR使用TRIzol和氯仿提取RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成性質(zhì)穩(wěn)定的cD?NA。隨后qRT-PCR檢測目的基因相對β-actin的表達(dá)水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：95℃預(yù)變性10 min；95°C退火10 s；60℃下退火20 s并在72℃下延伸35 s。2-ΔΔCt方法用于計(jì)算目的基因相對mRNA表達(dá)。引物序列如下。Caspase-3：Forward-5′-GCACCCAGCGA TGTAATAGA-3′，Reverse-5′-TTGGATGAAGGAGA?ACCC-3′；Bcl-2：Forward-5′-CAAGGACCAACTACAACCA-3′，Reverse-5′-AGGGAAGGGTCAGTCAGGTT-3′；Cyclin-D1：Forward-5′-CCTGATGATGAATCAGCATTT-3′，Reverse-5′-GGAGATGATGGAGGCAAGG-3′；Bax：Forward-5′-CCTTTACTGAAGTTATTGATTTCTC-3′，Reverse-5′-GGCAGTTAGACTTTGATGCACTTT-3′；p53：Forward-5′-CTGGCGGTGAAACCTG-3′，Reverse-5′-CCCCTGCAAGGGTATCCCTGC?GGT-3′；β-actin：Forward-5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，Reverse-5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.3 Western blot調(diào)整細(xì)胞數(shù)5×104個(gè)/ml接種至6孔板，80%細(xì)胞密度時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗滌1 min加入加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min后高速離心吸取蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.4 OGD細(xì)胞模型構(gòu)建HT22細(xì)胞體外正常培養(yǎng)待細(xì)胞密度達(dá)到30%左右，預(yù)先細(xì)胞給藥5、10、15、20、30和40 ng/ml秋水仙素處理12 h。隨后放入三氣培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件90%CO2、5%N2、5%O2，換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)8 h。取出細(xì)胞換成正常培養(yǎng)液，正常細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞活力、ROS變化和線粒體膜電位變化。

1.2.5 ROS活性檢測HT22細(xì)胞體外正常培養(yǎng)待細(xì)胞密度達(dá)到30%左右，預(yù)先細(xì)胞給藥30 ng/ml秋水仙素處理12 h。隨后放入三氣培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件90%CO2、5%N2、5%O2，換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。結(jié)束后每孔加入20μl ROS檢測試劑，避光1 h，搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀570 nm檢測細(xì)胞OD值進(jìn)行活力分析。

1.2.6 線粒體膜電位檢測HT22細(xì)胞體外正常培養(yǎng)待細(xì)胞密度達(dá)到30%左右，預(yù)先細(xì)胞給藥30 ng/ml秋水仙素處理12 h。隨后放入三氣培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件90%CO2、5%N2、5%O2，換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。結(jié)束后每孔加入30μl JC-1檢測試劑，避光12 h，隨后激光共聚焦觀察線粒體膜電位變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組件比較用F檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秋水仙素抑制U87細(xì)胞增殖能力 檢測不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖抑制作用，以確定最佳的藥物作用濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素對U87細(xì)胞增殖抑制作用隨著秋水仙素給藥濃度的增加而增加（P＜0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)給藥濃度達(dá)到30 ng/ml時(shí)秋水仙素抑制作用最強(qiáng)（P＞0.05），因此后續(xù)對U87細(xì)胞作用濃度選為30 ng/ml。見圖1。

圖1 不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of different concentrations of col-chicine on proliferation of glioma U87 cells

2.2 秋水仙素抑制PIK3/AKT信號通路和抑制U87細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)qRT-PCR和Western blot檢測秋水仙素給藥后對PIK3/AKT信號通路的影響以及下游促癌基因Caspase-3、Bcl-2和Cyclin-D1和抑癌基因Bax和p53的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素可以有效抑制促癌基因Caspase-3、Bcl-2和Cyclin-D1表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)抑癌基因Bax和p53的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)抑制PIK3和AKT的磷酸化（P＜0.05），從而抑制PIK3/AKT信號通路的激活。提示秋水仙素是通過阻滯PIK3/AKT信號通路的激活從而抑制U87細(xì)胞的增殖作用。見圖2、3。

圖2 PCR檢測秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.2 Effect of colchicine on PIK3/AKT signaling down-stream related proteins in glioma U87 cells detected by PCR

圖3 Western blot檢測秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.3 Effects of colchicin on PIK3/AKT signaling path-way and its downstream related proteins in glioma U87 cells

2.3 秋水仙素預(yù)處理可提高OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞活力10、20、30、40和50 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞活力具有明顯的保護(hù)作用（P＜0.05），而20 ng/ml濃度秋水仙素對OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞活力開始產(chǎn)生抑制作用，30 ng/ml時(shí)抑制作用最強(qiáng)。說明秋水仙素在30 ng/ml時(shí)對HT22產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此后續(xù)HT22細(xì)胞秋水仙素給藥濃度為30 ng/ml。見圖4。

圖4 不同濃度秋水仙素對OGD模型HT22細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of colchicin on vi-ability of HT22 cells in OGD model

2.4 秋水仙素預(yù)處理降低OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞ROS和線粒體膜電位的變化OGD誘導(dǎo)會刺激細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體的凋亡，活性氧ROS和線粒體膜電位的變化分別反映了這兩種細(xì)胞的生理反應(yīng)，而細(xì)胞在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體的凋亡時(shí)會產(chǎn)生NO來減緩ROS的產(chǎn)生和線粒體膜電位的降低。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，秋水仙素預(yù)處理組HT22細(xì)胞NO表達(dá)顯著增多（P＜0.05），ROS含量明顯降低（P＜0.05），同時(shí)線粒體膜電位也顯著降低（P＜0.05）。說明秋水仙素預(yù)處理可以有效緩解OGD誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞的氧化應(yīng)激和線粒體凋亡。見圖5、6。

圖5 30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細(xì)胞ROS表達(dá)的影響Fig.5 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on ROS expression in HT22 cells of OGD model

圖6 30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細(xì)胞線粒體膜電位影響Fig.6 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on mito-chondrial membrane potential of HT22 cells in OGD model

2.5 秋水仙素降低MMP-9和CRP的表達(dá)MMP-9和CRP是發(fā)生缺血性腦卒中的標(biāo)志細(xì)胞因子，OGD模型下，秋水仙素預(yù)處理后，ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9和CRP的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素可以有效抑制MMP-9和CRP的表達(dá)（P＜0.05），減緩OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞MMP-9和CRP的分泌。見圖7。

圖7 30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細(xì)胞MMP-9和CRP的影響Fig.7 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment onMMP-9 and CRP in OGD model HT22 cells

2.6 秋水仙素抑制PIK3/AKT信號通路和抑制OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡30 ng/ml秋水仙素可以減緩OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡。qRT-PCR和Western blot檢測秋水仙素預(yù)處理后OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞內(nèi)PIK3/AKT信號通路相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素同樣通過抑制AKT的磷酸化（P＜0.05），抑制促凋亡因子Capase-3、Bcl-2和Cyclin-D1表達(dá)（P＜0.05），從而緩解OGD誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡。見圖8、9。

圖8 PCR檢測30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細(xì)胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.8 PCR detection of 30 mg/ml colchicin pretreatment on OGD model effects of PIK3/AKT signaling pathway in HT22 cells

圖9 Western blot檢測30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細(xì)胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.9 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on down-stream related proteins of PIK3/AKT signaling pathway in HT22 cells

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是臨床上人顱內(nèi)常見原發(fā)性惡性腫瘤，近些年發(fā)病率逐漸增高且趨于年輕化［8］。腦膠質(zhì)瘤侵襲性強(qiáng)，常通過侵襲血管壁及膠質(zhì)細(xì)胞間的連接來浸潤、壓迫和破壞腦組織［2，9］。由于其與正常腦組織分界不清，手術(shù)難以徹底切除，術(shù)后極易復(fù)發(fā)［9-10］。而其對放療及化療的敏感性均欠佳，故患者預(yù)后差，死亡率高［9，11］。目前臨床上針對腦膠質(zhì)瘤尚無有效的藥物，因此，針對抗腦膠質(zhì)瘤藥物的研究就顯得尤為重要。腦膠質(zhì)瘤常常會壓迫腦神經(jīng)，造成神經(jīng)元細(xì)胞缺血再灌注造成腦卒中。因此腦卒中常常伴隨著腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。腦卒中是人類災(zāi)難性疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點(diǎn)，是世界范圍內(nèi)死亡和長期致殘的三大原因之一［9］，同時(shí)也是世界上單病種導(dǎo)致成人后天功能障礙的首位原因［12］。腦卒中主要原因是腦缺血再灌注引起的［9］。而腦缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，氧化還原平衡的破壞是其重要的病理特征［13］。因此，探索高效的抗氧化神經(jīng)保護(hù)及對腦缺血再灌注損傷的改善和治療具有重要的研究意義和臨床價(jià)值。

秋水仙素是萃取于百合科植物秋水仙的種子和球莖的一種植物堿［14］。它是白色或淡黃色的粉末或針狀晶體，最先用于治療風(fēng)濕病和痛風(fēng)，但已有研究報(bào)道其對腫瘤具有一定的治療效果［15］，但是關(guān)于秋水仙素治療腦膠質(zhì)瘤和缺血性腦卒中的作用如何，其如何發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。因此本研究以U87細(xì)胞和HT22細(xì)胞為研究對象，探討了不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和海馬神經(jīng)元細(xì)胞的抑制和保護(hù)作用。

本研究首先研究了秋水仙素對U87細(xì)胞增殖的影響，初步確定秋水仙素的作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 ng/ml的秋水仙素顯著抑制U87細(xì)胞增殖作用，同時(shí)對OGD模型中HT22具有一定的保護(hù)作用。為了研究秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用機(jī)制，我們檢測了腫瘤經(jīng)典信號通路PI3K/AKT在秋水仙素給藥后U87細(xì)胞中的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素抑制了AKT的磷酸化，同時(shí)降低下游促癌基因的表達(dá)，促進(jìn)下游抑癌基因的表達(dá)。這提示秋水仙素通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抑癌作用。同時(shí)我們檢測了HT22細(xì)胞在OGD模型中秋水仙素對PI3K/AKT的影響，結(jié)果同樣顯示秋水仙素抑制PI3K/AKT信號通路以及下游促凋亡基因的表達(dá)。這說明秋水仙素在對腦膠質(zhì)瘤發(fā)揮作用的同時(shí)對腦缺血再灌注損傷有很好的改善作用，且都是通過PI3K/AKT信號通路來實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)在HT22細(xì)胞OGD模型中秋水仙素抑制了ROS的釋放，降低線粒體膜電位從而減少細(xì)胞的凋亡，并且對腦缺血再灌注損失標(biāo)志蛋白MMP-9和CRP同樣具有抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果中秋水仙素通過PI3K/AKT信號通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)有效緩解腦缺血再灌注引發(fā)的損傷，但是秋水仙素在腦膠質(zhì)瘤和腦缺血再灌注中發(fā)揮作用的首觸靶分子是哪個(gè)基因，又是如何進(jìn)一步激活下游PI3K/AKT信號通路的，這將是我們下一步的研究重點(diǎn)。