李文慧 張 杰 劉旭恩（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（河南省精神病醫(yī)院）精神五科，新鄉(xiāng) 453003）

近年，糖尿病和抑郁癥極大加劇了全球疾病負(fù)擔(dān)，二者之間的關(guān)系也逐漸引起醫(yī)療人員的興趣［1］。糖尿病患者經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)心理健康問題，抑郁癥在糖尿病患者中的發(fā)病率是普通人群的兩倍，且與預(yù)后不良相關(guān)［2］。有抑郁癥狀的人發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)比無抑郁癥狀的人高37%～60%［3］。糖尿病與抑郁癥的合并癥是一項(xiàng)主要的臨床挑戰(zhàn)，因?yàn)槊糠N疾病都會(huì)因另一種疾病的存在而惡化［4］。糖尿病與抑郁癥共病患者的治療包括常規(guī)藥物治療、心理治療及聯(lián)合治療。目前應(yīng)用的藥物往往僅單獨(dú)針對(duì)抑郁癥或糖尿病。二氟甲基鳥氨酸是公認(rèn)的最有效的鳥氨酸脫羧酶特異性抑制劑，可作為鳥氨酸脫羧酶的底物，導(dǎo)致鳥氨酸脫羧酶發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)改變，減少細(xì)胞內(nèi)多胺含量［5］。已有研究表明，二氟甲基鳥氨酸抑制2型糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥厚及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［6-7］。目前尚無關(guān)于二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥的研究。本文旨在研究二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠的認(rèn)知功能障礙及血清代謝組學(xué)的調(diào)節(jié)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性，7周齡，體重（210±15）g，許可證號(hào)：SYXK（川）2014-189，置于溫控（22±1）℃和光控（200 lux，12 h光暗循環(huán)）動(dòng)物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 藥物與主要試劑 二氟甲基鳥氨酸（D193）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich，化學(xué)式：C6H12F2N2O2·xHCl·yH2O，分子量：182.17，純度≥98%；蘇木素-伊紅染液（D006-1-1）、5-羥色胺試劑盒（H104）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；5-羥吲哚乙酸試劑盒（HJIR-12628）購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1091）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗單克隆抗體Survivin（ab469）、Ki67（ab15580）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、GLT-1（ab231014）、BDNF（ab226843）、AMPKα1（ab3759）、PGC-1α（ab54481）、GLUT4（ab454）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 參考王宇紅等［8］方法建立糖尿病并發(fā)抑郁癥動(dòng)物模型，并隨機(jī)分為5組：對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、二氟甲基鳥氨酸低劑量組（DFMO 0.1）、二氟甲基鳥氨酸中劑量組（DFMO 0.25）、二氟甲基鳥氨酸高劑量組（DFMO 0.5）。二氟甲基鳥氨酸低、中、高劑量組分別用0.1、0.25、0.5 mmol/L二氟甲基鳥氨酸灌胃給藥，對(duì)照組及模型組灌胃同等體積生理鹽水，灌胃持續(xù)28 d。

1.2.2 HE染色 將腦組織以10%福爾馬林固定并進(jìn)行石蠟包埋切片厚度為4μm。用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，水洗，鹽酸乙醇分化，水洗藍(lán)化，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織并拍照。

1.2.3 TUNEL染色 將腦組織石蠟切片脫蠟處理，滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20℃～37℃作用20 min，PBS洗滌3次，加入50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育1 h，PBS洗滌1次，滴加0.2 ml標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min后，PBS洗滌3次，繼續(xù)在樣品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min后PBS洗滌3次，最后滴加0.3 ml DAB顯色液后于熒光顯微鏡下觀測(cè)。

1.2.4 RT-PCR TRIzol法提取各組大鼠腦組織中總RNA，Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（A260/A280），按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃延長(zhǎng)10 min；存儲(chǔ)于4°C條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.5 血清素和5-羥吲哚乙酸含量檢測(cè) 試劑盒檢測(cè)serotonin（5-HT）和metabolite 5-hydroxyindole?acetic（5-HIAA）含量。采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)儀系統(tǒng)檢測(cè)，每次進(jìn)樣20μl，流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的速度為0.5 ml/min。

1.2.6 血脂指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血脂指標(biāo)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.2.7 Western blot將各組大鼠腦組織冰上溶解25 min，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100℃變性5 min后，SDSPAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復(fù)3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩兩比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二氟甲基鳥氨酸改善糖尿病合并抑郁癥大鼠模型海馬神經(jīng)元病理損傷程度 如圖1所示，Con?trol組海馬神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊，染色均勻，間隙正常。Model組海馬神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮，呈空泡狀，排列紊亂。DFMO 0.1、0.25、0.5組海馬空泡數(shù)明顯減少，病理損傷程度明顯減輕。

圖1 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型海馬神經(jīng)元的影響Fig.1 Effects of difluoromethylornithine on hippocampal neurons in diabetic rats with depression

2.2 二氟甲基鳥氨酸促進(jìn)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型細(xì)胞凋亡 如圖2所示，細(xì)胞核呈現(xiàn)黃褐色為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。Model組陽性細(xì)胞明顯多于Control組，DFMO劑量組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明DFMO抑制細(xì)胞凋亡。

圖2 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of difluoromethornithine on apoptosis of hip-pocampal neurons in diabetic rats with depression

2.3 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax，降低Caspase-3 mRNA水平 如表1所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax顯著降低（P＜0.05），Caspase-3 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax顯著升高（P＜0.05），Caspase-3 mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型Sur-vivin、Caspase-3 mRNA水平，Bcl-2/Bax的影響（±s）Tab.1 Effects of difluoromethylornithine on Survivin and Caspase-3 mRNA levels and Bcl-2/Bax in dia-betic and depressed rats（±s）

表1 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型Sur-vivin、Caspase-3 mRNA水平，Bcl-2/Bax的影響（±s）Tab.1 Effects of difluoromethylornithine on Survivin and Caspase-3 mRNA levels and Bcl-2/Bax in dia-betic and depressed rats（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

Groups Dose（mmol/L）Bcl-2/Bax Survivin mRNA（2-ΔΔCt）1.00 0.13±0.031）0.14±0.061）0.65±0.041）2）0.88±0.082）Caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）1.00 3.02±0.381）2.93±0.421）1.79±0.361）2）1.18±0.292）1.23±0.17 0.15±0.041）0.17±0.061）0.63±0.051）2）0.98±0.072）Control Model DFMO DFMO DFMO--0.10 0.25 0.50

2.4 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型GLT-1、BDNF蛋白水平 如圖3所示，與Con?trol組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組GLT-1、BDNF蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組GLT-1、BDNF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of difluoromethornithine on GLT-1 and BDNF protein expression levels in diabetic rats with depression

2.5 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型5-HT、5-HIAA含量 如圖4所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組5-HT、5-HIAA含量顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組5-HT、5-HIAA含量顯著升高（P＜0.05）。

圖4 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型5-HT、5-HIAA含量的影響Fig.4 Effects of difluoromethornithine on 5-HT and 5-HI-AA contents in rats with diabetes mellitus compli-cated with depression

2.6 二氟甲基鳥氨酸降低糖尿病合并抑郁癥大鼠模型TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平 如表2所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，DFMO 0.25、0.5組TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。

表2 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（±s，mmol/L）Tab.2 Levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C（±s，mmol/L）

表2 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（±s，mmol/L）Tab.2 Levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C（±s，mmol/L）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

HDL-C 1.57±0.11 0.51±0.071）0.56±0.061）1.18±0.321）2）1.66±0.292）Groups Control Model DFMO DFMO DFMO Dose--0.10 0.25 0.50 TC 1.33±0.26 4.84±0.521）4.77±0.631）2.91±0.481）2）1.63±0.322）TG 0.32±0.06 1.61±0.381）1.56±0.241）1.14±0.131）2）0.69±0.092）LDL-C 0.14±0.05 0.82±0.071）0.79±0.061）0.41±0.041）2）0.12±0.052）

2.7 二氟甲基鳥氨酸升高糖尿病合并抑郁癥大鼠模型AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平 如圖5所示，與Control組相比，Model組和DFMO 0.1、0.25組AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與Model組 相 比，DFMO 0.25、0.5組AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

圖5 二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠模型MPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of difluoromethornithine on protein expres-sion levels of MPKα1，PGC-1αand GLUT4 in dia-betic rats with depression

3 討論

糖尿病是臨床常見的代謝性疾病，其中2型糖尿病占比約90%［9］。由于糖尿病目前無法根治，患者需要長(zhǎng)期服藥，給家庭及患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，容易使患者產(chǎn)生焦慮抑郁，而抑郁又影響睡眠、情緒及飲食等，導(dǎo)致患者的胰島素抵抗加重，β細(xì)胞分泌功能減弱，從而導(dǎo)致血糖升高，使糖尿病惡化［10］。糖尿病合并抑郁癥的常規(guī)治療效果并不理想，且目前尚無專用藥物。CUMS程序是模擬動(dòng)物抑郁癥的經(jīng)典方法，因?yàn)樵摮绦蚰７铝巳祟惿鐣?huì)常見的壓力事件，其有效性也得到了充分證實(shí)［11］。本文采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射鏈脲佐菌素進(jìn)行糖尿病模型的復(fù)制，再進(jìn)行CUMS模型的復(fù)制，觀測(cè)二氟甲基鳥氨酸對(duì)糖尿病合并抑郁癥大鼠的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，二氟甲基鳥氨酸可改善糖尿病合并抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷程度，通過降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平改善血脂水平，通過升高Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax比值，降低Caspase-3 mRNA水平抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

糖尿病是認(rèn)知功能發(fā)生障礙的危險(xiǎn)因素［12］。海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺失會(huì)導(dǎo)致谷氨酸濃度上升，影響認(rèn)知功能，而谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GLT-1）可調(diào)控谷氨酸水平，當(dāng)腦內(nèi)谷氨酸含量異常升高時(shí)，GLT-1通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)將細(xì)胞間隙中過量的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)代謝消除［13］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-de?rived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，通過與相應(yīng)受體絡(luò)氨酸激酶B結(jié)合對(duì)胚胎神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、誘導(dǎo)分化及突觸連接具有調(diào)節(jié)功能［14］。BDNF表達(dá)的降低與海馬等認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)的結(jié)構(gòu)紊亂及功能連接異常存在一定關(guān)聯(lián)，參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中GLT-1、BDNF蛋白水平明顯降低，在給予二氟甲基鳥氨酸干預(yù)后，海馬中GLT-1、BDNF明顯升高。說明二氟甲基鳥氨酸具有改善糖尿病合并抑郁癥大鼠認(rèn)知障礙的作用。

5-HT能系統(tǒng)是早發(fā)性抑郁發(fā)病機(jī)制中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，“單胺遞質(zhì)假說”認(rèn)為抑郁的發(fā)生與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT水平低下有關(guān)［16］。5-HIAA是5-HT經(jīng)A型單胺氧化酶作用生成5-羥吲哚乙醛，在醛脫氫酶的催化下生成的無活性酸性代謝終產(chǎn)物，其含量高低也能間接反映5-HT的水平變化。已有研究表明，5-HT能神經(jīng)遞質(zhì)的減退不僅導(dǎo)致情緒障礙的形成，還可影響其他遞質(zhì)的活動(dòng)誘發(fā)抑郁癥［17］。因此，選擇5-HT作為抗抑郁藥物的治療靶點(diǎn)，通過直接或間接增加突觸中5-HT含量治療抑郁癥［18］。于澤勝等［19］研究發(fā)現(xiàn)柴胡白芍藥對(duì)通過逆轉(zhuǎn)CUMS模型大鼠5-HT、5-HIAA水平的降低起抗抑郁作用。Ziziphi spinosae百合粉懸浮液對(duì)通過升高5-HT、5-HIAA含量減輕CUMS模型大鼠的抑郁癥狀。本文研究發(fā)現(xiàn)，二氟甲基鳥氨酸具有升高5-HT、5-HIAA含量的作用。提示二氟甲基鳥氨酸可改善糖尿病合并抑郁癥大鼠抑郁癥狀。

AMPK被稱為“細(xì)胞能量檢測(cè)器”，在脂肪組織中，可抑制脂肪分解，降低2型糖尿病患者身體中的高游離脂肪酸循環(huán)，改善糖尿病病情［20］。GLUT4是目前最有潛力的抗糖尿病藥物的作用靶點(diǎn)之一。研究表明，上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的表達(dá)有助于緩解2型糖尿病胰島素抵抗，從而治療和預(yù)防2型糖尿病［21］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated re?ceptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）是介導(dǎo)多種細(xì)胞能量代謝和核受體的重要因子，通過激活脂肪酸氧化、糖異生、線粒體呼吸的關(guān)鍵酶參與了脂代謝紊亂、胰島素抵抗、線粒體損傷的形成，PGC-1α可通過特定途徑增加海馬組織中BDNF的表達(dá)［22-23］。本文研究發(fā)現(xiàn)，二氟甲基鳥氨酸具有升高AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平的作用，說明二氟甲基鳥氨酸通過激活A(yù)MPKα1/PGC-1α/GLUT4通路對(duì)大鼠糖尿病合并抑郁癥具有改善作用。

本文研究結(jié)果表明，糖尿病合并抑郁癥大鼠模型中，二氟甲基鳥氨酸可改善大鼠海馬神經(jīng)元損傷及血脂水平，上調(diào)GLT-1、BDNF蛋白水平及5-HT、5-HIAA含量?？赡苁峭ㄟ^激活A(yù)MPKα1/PGC-1α/GLUT4實(shí)現(xiàn)的。本研究闡明了二氟甲基鳥氨酸治療糖尿病和抑郁癥合并癥的潛力。