張 晗 孟憲勇 武海霞 楊建明 吳苗苗 董曉華

（河北北方學院神經(jīng)藥理學省重點實驗室，張家口 075000）

沙眼衣原體（chlamydia trachomatis，Ct）引起的泌尿生殖系統(tǒng)感染居性傳播疾病首位，具有隱匿性，早期不容易被發(fā)現(xiàn)，最終引起盆腔炎、輸卵管積水，甚至異位妊娠及不孕不育［1-2］。20世紀80年代研究發(fā)現(xiàn)，Ct攜帶的質(zhì)粒是分子量小、基因序列高度保守的雙鏈環(huán)狀DNA分子［3-4］，可編碼8種蛋白，同時調(diào)控20余種蛋白合成。在質(zhì)粒編碼的8種蛋白中，Pgp3是唯一具有分泌特性的蛋白，既可分泌至宿主細胞胞漿中，并隨著宿主細胞破裂釋放至宿主體內(nèi)［5］。長期以來，研究認為Pgp3對Ct感染發(fā)揮重要作用，但始終未找到Pgp3的作用靶點以證明其重要性。抗菌肽廣泛存在于生物體內(nèi)，可協(xié)助機體抵御外源微生物侵害，是生物體先天性防御系統(tǒng)的重要組成成分［6-7］。LL37是人抗菌肽的一種，體外實驗表明其可殺滅衣原體，降低宿主細胞感染率。Pgp3可能是Ct的毒力因子，可抑制宿主防御系統(tǒng)殺滅Ct。為探討Pgp3在Ct感染宿主過程的作用，本文采用GST pull-down和免疫熒光技術研究Pgp3與LL37的相互作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料pGEX-6p/Pgp3重組質(zhì)粒、E.coliXLlblue菌株、純化的Ct內(nèi)原體（elementary body，EB）由UTHSCSA鐘光明實驗室提供；HeLa細胞（cat#CCL2，美國標準菌株保存中心）；LL-37（cat#61302，Chantilly，VA）；Hoechst（blue，Sigma）；IPTG（Invitrogen，Carlsbad，USA）；Prescission蛋白酶（Pharmacia，USA）；Ct包涵體兔一抗、Cy2標記的羊抗兔IgG（GE Heahhcare）；Glutathione Sepharose 4B（Amersham Pharmacia Biotech，Inc，Piscataway，NJ）；血清及DMEM細胞培養(yǎng)基（美國Gibco）；多聚甲醛（Sigma，St.Luis，MO）；多黏菌素B（Sigma，St.Louis，MO）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 實驗分為6組：EB組（EB）、LL37組（LL37+EB）、Pgp3+LL37組（1、10、100μg/ml Pgp3+LL37+EB）、Pgp3（100μg/ml）組（100μg/ml Pgp3+EB）。30μg/ml LL37與不同濃度Pgp3蛋白共同孵育2 h后，處理Ct 0.5 h后得到Ct感染液備用。HeLa細胞接種于放有載玻片的24孔板，培養(yǎng)18～24 h至單層，棄細胞培養(yǎng)液，30μg/ml DEAE-dextran處理10 min，加入Ct感染液，37℃孵育2 h，棄上清，加入含有2μg/ml放線菌酮的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)40 h。

1.2.2 免疫熒光實驗Ct感染HeLa細胞40 h，4%多聚甲醛室溫固定30 min，2%皂素透膜處理1 h，PBS洗滌，加入1%BSA室溫封閉1 h，依次加入兔抗Ct包涵體抗體，37℃孵育1 h；加入Cy2標記的羊抗兔抗體、Hoechst，37℃孵育1 h，PBS洗滌、封片，干燥，熒光顯微鏡下觀察，隨機選取10個連續(xù)視野，計數(shù)各視野下HeLa細胞和包涵體數(shù)，計算感染率，取平均值作為各組Ct感染率，實驗重復3次。

1.2.3 Pgp3、Pgp3融合蛋白表達與純化 將已構(gòu)建好的pGEX-6p/Pgp3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至XL1-Blue大腸桿菌，加入200μmol/L IPTG 37℃誘導3 h，低速離心，加入Triton-X100裂解液超聲破菌后高速離心，將上清加入Glutathione Sepharose 4B Beads得到純化的結(jié)合GST的Pgp3融合蛋白，加入Prescission蛋白酶切割得到不含GST標簽的Pgp3純化蛋白，超濾管Centricon YM-10濃縮和多黏菌素B去除內(nèi)毒素，BCA法測定Pgp3蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。Pgp3不同片段的純化蛋白及GST融合蛋白制備方法同上。

1.2.4 GST pull-down實驗 取50μl谷胱甘肽共軛的聚酯糖小球于EP管中，PBST潤洗2次，加入帶有GST的Pgp3融合蛋白混勻，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h，PBST洗3次，PBS洗1次，加入LL37（30μg/ml）37℃振蕩孵育2 h，離心，取上清，加入5×loading buffer，煮沸8 min備用，PBST洗3次，PBS洗1次，取一定量的PBS，加入5×loading buffer溶解，煮沸8 min，高速離心，取上清。加入15%SDS PAGE，Western blot檢測LL37水平，以GST蛋白結(jié)合聚酯糖小球為對照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用Fisher確切概率法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Pgp3和LL37對HeLa細胞Ct感染率的影響根據(jù)預實驗結(jié)果，確定LL37濃度為30μg/ml，30μg/ml時Ct對HeLa細胞的感染率從50%降至10%，10%感染率既可保證有一定數(shù)量HeLa細胞被感染，又為后續(xù)不同濃度Pgp3增強感染率的作用提供可觀察空間。將不同劑量純化的Pgp3（1、10、100μg/ml）與LL37預先孵育后再處理Ct，最后感染HeLa細胞，結(jié)果顯示，10、100μg/ml Pgp3可逆轉(zhuǎn)LL37對Ct的殺傷作用，感染率顯著上升，1μg/ml Pgp3對LL37的影響無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），單獨加入100μg/ml Pgp3對Ct感染率影響無統(tǒng)計學意義。Ct的2種血清型D、L2及鼠肺炎衣原體（mouse pneumonitis，MoPn）的實驗結(jié)果一致（圖1）。

圖1 LL37介導的Pgp3對Ct（D、L2和MoPn）對HeLa細胞感染率的影響Fig.1 Effect of Pgp3 on infection rate of Ct（D，L2 and MoPn）mediated by LL37 in HeLa cells

2.2 Pgp3與LL37的相互結(jié)合 預實驗結(jié)果表明，Pgp3并不分解LL37，因此Pgp3與LL37作用方式可能是結(jié)合。采用GST pull-down和Western blot驗證Pgp3融合蛋白與LL37的作用方式，結(jié)果顯示，LL37 input（條帶1）有LL37曝光，表明整個工作系統(tǒng)和LL37抗體良好；單獨加入GST蛋白（條帶2）和Pgp3融合蛋白（條帶5）無曝光，表明LL37抗體具有特異性；GST+beads+LL37 pellet（條帶3）無LL37曝光而GST+beads+LL37 supernatant（條帶4）有LL37曝光，表明LL37不與GST結(jié)合；Pgp3+beads+LL37 super?natant（條帶7）無LL37曝光，而Pgp3+beads+LL37 pellet（條帶6）在4 kD位置處有LL37曝光，表明LL37可與Pgp3結(jié)合，在58 kD附近也有1個明顯的曝光帶，本研究中Pgp3是帶有GST的融合蛋白，GST：26 kD，Pgp3：28 kD，LL37：4 kD，26+28+4=58 kD，推測58 kD位置處可能是GST-Pgp3-LL37結(jié)合體，LL37和Pgp3結(jié)合牢固，8 min煮沸變性并不能將全部的LL37和Pgp3斷開，斷開部分在4 kD曝光，而未斷開部分（GST-Pgp3-LL37）則在58 kD附近曝光（圖2）。采用同樣方法觀察Pgp3是否可與其他抗菌肽結(jié)合，結(jié)果顯示，Pgp3同樣能夠結(jié)合Cramp（小鼠體內(nèi)與人源性抗菌肽cathelicidin相關抗菌肽）、HNP3（人類α防御素3）、HBD2（人類β防御素2）、HBD3（人類β防御素3），但不能和HNP1（人類α防御素1）結(jié)合（圖3），表明Pgp3對抗菌肽的結(jié)合具有選擇性，且Pgp3可逆轉(zhuǎn)除HNP1外的以上抗菌肽對EB（L2血清型）的殺傷作用，但僅有LL37可在上方曝光出條帶，即LL37與Pgp3的結(jié)合是最牢固的，對LL37的抑制作用最強。

圖2 GST pull-down和Western blot驗 證Ppg3結(jié) 合LL37形成穩(wěn)定復合物Fig.2 Pgp3 binds to LL-37 to form stable complexes ex-amined by GST pull-down and Western blot

圖3 Pgp3與LL37的結(jié)合域驗證Fig.3 Confirmation of binding domain of Pgp3 with LL37

2.3 與LL37結(jié)合的Pgp3片段確定 結(jié)果2.2證實Pgp3能夠與LL37結(jié)合，Pgp3是三聚體蛋白，每個單體具有264個氨基酸（28 kD），而人類抗菌肽一般是具有幾十個氨基酸的小分子肽，LL37分子量是4 kD，為進一步驗證Pgp3與LL37結(jié)合，并找到Pgp3與LL37的結(jié)合位點，采用基因克隆技術純化出不同片段的Pgp3融合蛋白，即Pgp3全長（1～264 aa），C段（133～264 aa）、N段（1～66 aa）、中間M段（67～132 aa），N+M段（1～132 aa），采用GST pull-down法篩選Pgp3與LL37結(jié)合的活性片段，Pgp3全長（1～264 aa，條帶4）、N+M段（1～132 aa，條帶5）、M段（67～132 aa，條帶8）在4 kD均有LL37曝光帶，即可與LL37結(jié)合（圖3）；而C段（133～264 aa，條帶6）、N端（1～66 aa，條帶7）并不能與LL37結(jié)合。Pgp3全長（1～264 aa）在58 kD附近有曝光，可能是GST-Pgp3-LL37結(jié)合的復合物，GST：26 kD，Pgp3全長（1～264 aa）：28 kD，LL37：4 kD，26+28+4=58 kD；同樣N+M段（1～132 aa）在44 kD附近有曝光，可能是GST-Pgp3（1～133 aa）-LL37結(jié)合的復合物，GST：26 kD，Pgp3（1～132 aa）：14 kD，LL37：4 kD，26+14+4=44 kD；Pgp3中間段（67～132 aa，條帶8）在37 kD附近曝光帶可能是GSTPgp3（67-132aa）-LL37結(jié)合的復合物，GST：26 kD，Pgp3（67～132 aa）：7 kD，LL37：4 kD，26+7+4=37 kD。

2.4 Pgp3不同片 段與LL37結(jié)合對HeLa細 胞Ct感染率的影響 為進一步驗證LL37與Pgp3中間段（67～132 aa）結(jié)合，課題組培養(yǎng)HeLa細胞，以Ct（L2血清型）對HeLa細胞的感染率為檢測指標，免疫熒光法觀察Pgp3全長、中間段、去除中間段（100μg/ml）與LL37（30μg/ml）混合后對-對HeLa細胞Ct感染率的影響，Pgp3全長（1～264 aa）、中間段（67～132 aa）感染率較單獨LL37組顯著升高（P＜0.01），而去除中間段（1～66 aa…133～264 aa）并不干擾LL37對Ct的殺傷作用，同時陰性對照組（未加入LL37）的全長、中間段、去除中間段對Ct無影響（圖4）。

圖4 LL37介導的Pgp3全長及不同片段對HeLa細胞Ct感染率的影響Fig.4 Effects of Pgp3 full length and different fragments on infection rate of Ct mediated by LL37 in HeLa cells

3 討論

Ct的質(zhì)粒包含8個開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼8種質(zhì)粒蛋白，分別命名為pORF1～pORF8，pORF5即Pgp3，是唯一的質(zhì)粒編碼的分泌蛋白，即表達后可分泌至宿主細胞的胞漿，而其他7種質(zhì)粒蛋白只能分布于Ct菌體內(nèi)。Pgp3可損傷小鼠生殖道組織，上調(diào)TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平。Pgp3對Ct感染宿主起重要作用，但未見相關報道。研究表明，Ct質(zhì)粒缺失株同野生株在體外細胞培養(yǎng)中感染率無明顯差異，但在動物體內(nèi)，質(zhì)粒缺失株感染能力遠低于野生株，其50%感染劑量（ID50）是野生株的400倍［8-9］，說明質(zhì)粒對Ct致病起重要作用，且與體內(nèi)環(huán)境密切相關。本研究顯示，Pgp3可與人抗菌肽LL37結(jié)合，抑制LL37對Ct的殺傷作用，從而促進Ct感染宿主細胞，為質(zhì)粒缺失株感染能力在體內(nèi)和體外不一致現(xiàn)象提供了證據(jù)。本研究模擬的感染過程并非Ct首次進入宿主后感染宿主的過程，而是當宿主細胞被感染后，隨宿主細胞破裂釋放出Pgp3和具有感染力的Ct EB再次感染宿主細胞的過程，因此，Ct首次感染宿主具有哪些逃避宿主防御系統(tǒng)的機制仍需進一步研究。

本研究采用GST pull-down法證實了Pgp3與LL37的作用方式是結(jié)合，Western blot結(jié)果顯示僅在目標蛋白位置曝光，但在4 kD和58 kD處都有曝光條帶，LL37的分子量為4 kD，那么58 kD處曝光的原因為何？本研究將融合GST的Pgp3蛋白和beads混合，又與LL37充分接觸，形成beads-GST-Pgp3-LL37，煮沸、離心沉淀最終得到的理論上應為LL37和GSTPgp3，但在58 kD附近也有1個明顯的曝光帶，GST：26 kD，Pgp3：28 kD，LL37：4 kD，（26+28+4）kD=58 kD，證明Pgp3和LL37的結(jié)合非常牢固，8 min煮沸變性并不能將全部LL37和GST-Pgp3斷開。

Pgp3是三聚體蛋白，各單體具有264個aa，分為N段、C段和中間段，而人抗菌肽一般是具有幾十個aa的小分子肽，因此LL37僅能結(jié)合在Pgp3的某段，即Pgp3抑制LL37作用的活性片段。根據(jù)Pgp3的結(jié)構(gòu)，采用基因克隆技術純化Pgp3的不同片段，Pgp3全長（1～264 aa），N段（1～66 aa）、C段（133～264 aa）、中間段（M）（67～132 aa）、N+M段（1～132 aa）、去除M段的全長（1～66 aa…133～264 aa），證實Pgp3中間段（67～132 aa）與LL37結(jié)合。LL37是人抗菌肽的一種，Pgp3與 其他抗菌肽（Cramp、HBD2、HBD3、HNP3）也具有一定結(jié)合，但結(jié)合最為牢固和最具特異性的是LL37，Pgp3與其他抗菌肽的相互作用仍需進一步研究。

Pgp3是Ct質(zhì)粒編碼蛋白之一，研究表明Pgp3可引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平升高，損傷小鼠生殖道［10］；Pgp3的天然結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定的三聚體，其C端結(jié)構(gòu)域類似于TNF-α受體結(jié)合域，通過激活TNF受體信號通路促進鼠衣原體誘導的輸卵管積液［11-14］；Pgp3可通過對抗人抗菌肽LL37調(diào)節(jié)免疫反應，促進Ct感染宿主［14］；同時Pgp3核酸疫苗對衣原體感染具有一定免疫保護作用［15］；證明Pgp3在Ct致病過程中起重要作用。隨著分子生物學與蛋白質(zhì)組學技術發(fā)展，Pgp3的深入研究將為Ct感染治療和診斷、Ct疫苗與診斷抗原等提供新思路。