赫瑋，左勇

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海200025

Polo樣蛋白激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其蛋白水平具有嚴(yán)格的細(xì)胞周期依賴性。激活PLK1可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶B（CDK1-cyclin B）復(fù)合物去磷酸化、磷酸化細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白170（cytoplasmic linker protein-170，Clip-170）調(diào)節(jié)其與微管的結(jié)合［1］，磷酸化并激活后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C）［2］等機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換、有絲分裂以及胞質(zhì)分裂。由于PLK1參與多種關(guān)鍵的細(xì)胞周期事件，因此成為癌癥治療藥物研發(fā)的靶標(biāo)之一。

急性T淋巴細(xì)胞白血?。╝cute T-1ymphocytic leukemia，T-ALL）是T淋巴母細(xì)胞增殖異常導(dǎo)致的一種血液疾病，臨床發(fā)病率達(dá)1.7/10萬(wàn)［3］。T-ALL患者主要表現(xiàn)為血原始細(xì)胞計(jì)數(shù)較高、縱隔腫塊及中樞神經(jīng)浸潤(rùn)。T-ALL細(xì)胞具有高侵襲性，其惡性行為與細(xì)胞增殖失控等原因密不可分［4］。目前，中醫(yī)藥治療白血病的研究不斷發(fā)展。與傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物相比，中藥天然產(chǎn)物的毒副反應(yīng)較小，且不易出現(xiàn)耐藥性。冬凌草甲素（oridonin）是一種貝殼杉烯二萜，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可通過(guò)不同機(jī)制明顯抑制白血病等多種腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲能通過(guò)Fas/Fasl通路調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡［5］；能選擇性剪切t(8；21)M2b白血病細(xì)胞的原癌蛋白AML-ETO而發(fā)揮治療作用［6］。Jurkat細(xì)胞目前常被用于T-ALL的體外研究，我們以Jurkat細(xì)胞為模型，研究冬凌草甲素對(duì)T-ALL的抑制作用及機(jī)制，為冬凌草甲素應(yīng)用于靶向治療T-ALL提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要細(xì)胞與質(zhì)粒人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞和人腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞293T（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院北部實(shí)驗(yàn)中心保存）。pCMV-flag-PLK1質(zhì)粒（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司），psPAX2、pMD2.G質(zhì)粒、pCMV-Δ8.91（上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室惠贈(zèng)）。

1.1.2主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（上海富衡生物科技有限公司），胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美 國(guó)），Lipofectamine 3000轉(zhuǎn) 染 試 劑（Invitrogen，美國(guó)），冬凌草甲素（辰光生物科技有限公司），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、高保真DNA聚合酶（上海翊圣生物科技有限公司），瑞士吉姆薩染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），CCK-8試劑盒（Dojindo，日本），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PLK1抗體、WEE1抗體（Santa Cruz，美國(guó)），GAPDH抗體（上海康城生物工程有限公司），BubR1抗體、Bub1抗體、Aurora A抗體、Aurora B抗體、HSP90抗體、CDC25c抗體、CDC27抗體（Abcam，英國(guó)），Ub抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)），Anti-FLAG M2 Magnetic Beads（Sigma，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔/抗鼠二抗（Jackson ImmunoResearch，美國(guó)），化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore，美國(guó)），Cocktail（Biotool，瑞士），MG132（Selleck，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞和293T細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期收集待測(cè)細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸緩沖液（phosphate butter saline，PBS）洗滌3遍，重懸細(xì)胞于1 mL PBS中，邊振蕩邊逐滴加入3 mL無(wú)水乙醇，-20℃固定過(guò)夜。次日離心后棄上清液，每個(gè)樣品中加入0.5 mL配置好的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，37℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況收集待測(cè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，棄上清。用100μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor488和10μL PI，避 光、室 溫 孵 育15 min后 加 入400μL 1×binding buffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各蛋白表達(dá)收集待測(cè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入SDS細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，收集上清后用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchonininc acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度。各樣品加入上樣緩沖液后取40μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋后的一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃膜成像，定量分析目的蛋白。

1.2.5瑞士吉姆薩染色收集待測(cè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后充分吹打混勻，制作細(xì)胞涂片。加入50μL瑞士吉姆薩染色A液等待1 min，加入100μL瑞士吉姆薩染色B液等待10 min，用自來(lái)水從玻片一端輕輕沖洗干凈后晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況待測(cè)細(xì)胞接種于96孔板中，接種濃度為每孔細(xì)胞2×105/100μL，分別加入終濃度為0、1、5、10、20、40μmol/L的冬凌草甲素（每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔）。將96孔板轉(zhuǎn)移至37℃恒溫、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值（D）。生長(zhǎng)率（%）=（處理孔D值-空白孔D值）/（對(duì)照孔D值-空白孔D值）×100%。

1.2.7免疫沉淀收集待測(cè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解細(xì)胞后收集的上清液取1/20用于對(duì)照input，其余用于免疫沉淀。清洗磁珠，在清洗后的磁珠中加500μL稀釋后的樣本，4℃翻轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。過(guò)夜后的樣品用RIPA裂解液洗滌3次，加入1×SDS裂解液，100℃煮樣10 min，EP管中的上清可用于Western blotting分析。

1.2.8細(xì)胞熱力學(xué)遷移實(shí)驗(yàn)收集待測(cè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，用PBS重懸細(xì)胞沉淀，按1∶100比例加入Cocktail，用液氮反復(fù)凍融裂解細(xì)胞。在細(xì)胞裂解液中加入DMSO或終濃度為100μmol/L的冬凌草甲素，溫度梯度孵育后收集蛋白樣品用于Western blotting分析。

重復(fù)以上步驟裂解待測(cè)細(xì)胞，在細(xì)胞裂解液中加入不同終濃度的冬凌草甲素，孵育后收集蛋白樣品用于Western blotting分析。

1.2.9分子對(duì)接在Swiss-TargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）網(wǎng)站繪制冬凌草甲素的3D結(jié)構(gòu)，對(duì)接前用AUTODOCK（4.2版）軟件預(yù)處理冬凌草甲素3D結(jié)構(gòu)并設(shè)置為對(duì)接配體，預(yù)處理PLK1蛋白質(zhì)分子3D結(jié)構(gòu)并設(shè)置為接的大分子。設(shè)置對(duì)接參數(shù)后將兩者對(duì)接，用PyMOL軟件進(jìn)行分析對(duì)接結(jié)果。

1.2.10構(gòu)建PLK1突變質(zhì)粒設(shè)計(jì)PLK1蛋白Cys67或Cys133位點(diǎn)突變引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。以pCMV-flag-PLK1質(zhì)粒為模板進(jìn)行反應(yīng)及重組，轉(zhuǎn)化并測(cè)序后獲得Cys67位點(diǎn)突變質(zhì)粒pCMVflag-PLK1-M1與Cys133位點(diǎn)突變質(zhì)粒pCMV-flag-PLK1-M2。

表1 PLK1蛋白Cys67位點(diǎn)（M1）及Cys133位點(diǎn)（M2）突變引物序列（5′→3′）Tab 1 Cys67（M1）and Cys133（M2）mutation primers of PLK1 protein sequence（5′→3′）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 8.0.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖與統(tǒng)計(jì)分析，各組間數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料用x±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素抑制Jurkat細(xì)胞增殖

CCK-8法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖情況的影響，觀察到10μmol/L濃度冬凌草甲素即可顯著抑制Jurkat細(xì)胞增殖（圖1A）。我們選擇低濃度冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞24 h，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)低劑量冬凌草甲素不誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖1B）。以上結(jié)果顯示冬凌草甲素可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，且低劑量冬凌草甲素不誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。

2.2 冬凌草甲素誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞G2/M期阻滯

用冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞24 h，細(xì)胞經(jīng)PI染色后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示當(dāng)冬凌草甲素濃度達(dá)6μmol/L和8μmol/L時(shí)，處于G2/M期的Jurkat細(xì)胞顯著增多（圖2A、B）；用6μmol/L冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)6μmol/L冬凌草甲素作用12 h后，G2/M期Jurkat細(xì)胞數(shù)即開(kāi)始增加并持續(xù)至加藥后48 h（圖2C、D）。上述結(jié)果表明冬凌草甲素可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

為深入觀察冬凌草甲素對(duì)Jurkat細(xì)胞有絲分裂的影響，我們用濃度為6μmol/L的冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞24 h，瑞士吉姆薩染色結(jié)果顯示冬凌草甲素處理后，有絲分裂期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表現(xiàn)為細(xì)胞核體積增大，染色質(zhì)濃縮為染色體，染色單體分離（圖2E）。在Jurkat細(xì)胞加入濃度為6μmol/L冬凌草甲素，0、12、24 h分別提取總蛋白并用Western blotting方法檢測(cè)cyclin B蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可使cyclin B表達(dá)升高（圖2F）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明冬凌草甲素可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

圖2低劑量冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig 2 Effect of low concentration oridonin on the cell cycle in Jurkat cells

2.3 冬凌草甲素上調(diào)Jurkat細(xì)胞PLK1蛋白水平

細(xì)胞周期事件的發(fā)生受到細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控，許多蛋白激酶在細(xì)胞周期的不同階段催化不同的細(xì)胞周期蛋白發(fā)生磷酸化，促發(fā)細(xì)胞周期進(jìn)程。我們以“mitosis”為關(guān)鍵詞檢索Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與有絲分裂相關(guān)的基因信息，檢索結(jié)果顯示有7 690個(gè)基因可能參與調(diào)控有絲分裂，我們選取排名靠前的5個(gè)蛋白激酶BuBR1、BuB1、PLK1、Aurora A、Aurora B展開(kāi)研究（表2）。用濃度為6μmol/L的冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞12和24 h后，檢測(cè)細(xì)胞中BuBR1、BuB1、PLK1、Aurora A、Aurora B蛋白的表達(dá)情況。Western blotting結(jié)果顯示冬凌草甲素處理后，PLK1蛋白表達(dá)顯著增加，而其他4種蛋白的表達(dá)量未發(fā)生明顯變化（圖3）。鑒于PLK1蛋白和細(xì)胞周期調(diào)控的密切關(guān)系，我們推測(cè)冬凌草甲素通過(guò)上調(diào)PLK1誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生有絲分裂阻滯。

表2 Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與有絲分裂相關(guān)的基因信息Tab 2 Searching the Genecards database with"mitosis"as key word

圖3低劑量冬凌草甲素對(duì)有絲分裂相關(guān)蛋白激酶表達(dá)的影響Fig 3 Effect of low concentration oridonin on the expression of mitosis-related kinase

2.4 冬凌草甲素促進(jìn)PLK1下游蛋白磷酸化

細(xì)胞周期蛋白BuBR1、CDC25c、CDC27的磷酸化和活性受PLK1調(diào)控，我們通過(guò)檢測(cè)這些蛋白的磷酸化水平來(lái)反映PLK1的活性。分別用6μmol/L冬凌草甲素和274 ng/mL的PLK1激動(dòng)劑Noc處理Jurkat細(xì)胞，于0、6、12、18、24 h提取細(xì)胞總蛋白，用Western blotting方法檢測(cè)PLK1下游蛋白BuBR1、CDC25c、CDC27的磷酸化情況。因?yàn)锽uBR1、CDC25c、CDC27的磷酸化抗體效果不佳，我們選用以上激酶的總蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：用Noc處理Jurkat細(xì)胞后，PLK1下游蛋白的磷酸化水平隨藥物處理時(shí)間的增加而加強(qiáng)；6μmol/L冬凌草甲素誘導(dǎo)PLK1下游蛋白磷酸化水平在12 h達(dá)高峰，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)其磷酸化水平略有降低，但始終高于未加入冬凌草甲素的對(duì)照組（圖4A）。此結(jié)果表明冬凌草甲素可上調(diào)PLK1蛋白激酶活性。

WEE1是細(xì)胞周期依賴性激酶CDK1的抑制性激酶，WEE1被PLK1磷酸化后經(jīng)泛素化修飾降解。我們也檢測(cè)了WEE1的蛋白含量，結(jié)果顯示W(wǎng)EE1蛋白含量在冬凌草甲素處理12 h后顯著減少（圖4B），表明冬凌草甲素上調(diào)PLK1活性。

圖4冬凌草甲素對(duì)PLK1下游蛋白磷酸化水平的影響Fig 4 Effect of oridonin on the phosphorylation level of PLK1 downstream protein

2.5 冬凌草甲素抑制PLK1蛋白發(fā)生泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解

研究表明PLK1在細(xì)胞有絲分裂完成后通過(guò)泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解，我們進(jìn)一步對(duì)冬凌草甲素是否通過(guò)抑制PLK1蛋白的泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解來(lái)維持蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行探討。

我們?cè)赑LK1過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞中分別加入濃度為0、10、20、50μmol/L的冬凌草甲素，處理24 h后通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)獲得外源性表達(dá)的Flag-PLK1蛋白，通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)PLK1泛素化修飾水平的改變。結(jié)果顯示冬凌草甲素抑制了Flag-PLK1蛋白的泛素化修飾，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)（圖5）。

圖5冬凌草甲素對(duì)PLK1蛋白泛素化修飾水平的影響Fig 5 Effect of oridonin on the level of ubiquitination modification for PLK1 protein

2.6 冬凌草甲素可直接與PLK1蛋白結(jié)合

我們運(yùn)用細(xì)胞熱力學(xué)遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)PLK1蛋白的熱穩(wěn)定性的影響，以推斷冬凌草甲素是否與PLK1形成復(fù)合物。我們?cè)贘urkat細(xì)胞裂解液中加入DMSO或終濃度為100μmol/L的冬凌草甲素室溫孵育30 min，分別在45.0、46.7、49.3、52.5、56.9、60.2℃孵育3 min后，Western blotting檢測(cè)不同溫度條件下冬凌草甲素對(duì)PLK1的蛋白量的影響。發(fā)現(xiàn)在45.0、46.7、49.3、52.5、56.9、60.2℃處理溫度下，PLK1蛋白量減少，說(shuō)明冬凌草甲素能通過(guò)與PLK1形成復(fù)合物而降低PLK1的熱穩(wěn)定性（圖6A、B）。

由于46.7℃孵育后冬凌草甲素對(duì)PLK1蛋白的穩(wěn)定性影響最大，我們進(jìn)一步用46.7℃進(jìn)行熱處理，探討不同濃度冬凌草甲素對(duì)PLK1蛋白穩(wěn)定性的影響，驗(yàn)證冬凌草甲素是否與PLK1蛋白直接結(jié)合。在Jurkat細(xì)胞裂解液中加入DMSO或終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μmol/L的冬凌草甲素，46.7℃孵育后Western blotting檢測(cè)PLK1蛋白含量。結(jié)果顯示，與加入DMSO的對(duì)照組相比，PLK1蛋白穩(wěn)定性與冬凌草甲素濃度負(fù)相關(guān)（圖6C、D）。以上結(jié)果證明冬凌草甲素可與PLK1蛋白直接結(jié)合。

2.7 冬凌草甲素與PLK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接

圖6不同溫度或濃度條件下冬凌草甲素對(duì)PLK1穩(wěn)定性的影響Fig 6 Effect of oridonin on the stability of PLK1 under different temperatures or concentration

通過(guò)檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB），我們獲得PLK1蛋白與其ATP競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑BI2536的復(fù)合物 結(jié) 構(gòu)（PDB編 號(hào)：2RKU，圖7A）。我 們 使 用AUTODOCK軟件（4.2版）模擬冬凌草甲素與PLK1蛋白（PDB編號(hào)：2RKU）的對(duì)接情況（圖7B），經(jīng)PyMOL軟件分析對(duì)接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素與PLK1復(fù)合物的對(duì)接能量為-31.1 J/mol，在對(duì)接口袋中PLK1蛋白有2個(gè)半胱氨酸殘基（Cys67和Cys133）與冬凌草甲素相距較近，可能會(huì)形成共價(jià)鍵。由此推測(cè)，PLK1蛋白Cys67或Cys133位點(diǎn)對(duì)PLK1與冬凌草甲素直接結(jié)合發(fā)揮重要作用。

圖7冬凌草甲素與PLK1對(duì)接位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig 7 Prediction of the docking site of oridonin and PLK1

2.8 PLK1蛋白上Cys67或Cys133位點(diǎn)參與冬凌草甲素與PLK1蛋白直接結(jié)合且上調(diào)PLK1蛋白穩(wěn)定性

通過(guò)分析冬凌草甲素與PLK1蛋白質(zhì)分子對(duì)接模型，我們推測(cè)PLK1蛋白氨基酸殘基Cys67或Cys133可能對(duì)PLK1與冬凌草甲素直接結(jié)合發(fā)揮重要作用，故通過(guò)定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建Cys67、Cys133位點(diǎn)突變?yōu)樯彼岬耐蛔冑|(zhì)粒。分別在轉(zhuǎn)染pCMV-flag-PLK1、pCMV-flag-PLK1-M1、pCMV-flag-PLK1-M2質(zhì)粒的239T細(xì)胞裂解液中加入DMSO或濃度為200μmol/L的冬凌草甲素，經(jīng)46.7℃孵育后Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示突變后每組Flag-PLK1蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯變化（圖8A、B），即PLK1蛋白分子的氨基酸殘基Cys67或Cys133突變后，冬凌草甲素不再誘導(dǎo)PLK1蛋白穩(wěn)定性發(fā)生變化，提示冬凌草甲素不再與PLK1蛋白直接結(jié)合。

我們?cè)谵D(zhuǎn)染野生型及突變型質(zhì)粒的293T細(xì)胞中分別加入濃度為0或50μmol/L的冬凌草甲素，24 h后收集蛋白裂解液經(jīng)免疫沉淀獲得外源性表達(dá)的PLK1蛋白，通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)其泛素化修飾水平的影響。結(jié)果顯示Cys67位點(diǎn)或Cys133位點(diǎn)突變后，冬凌草甲素對(duì)PLK1泛素化修飾的抑制顯著減弱（圖8C），提示PLK1蛋白上Cys67或Cys133位點(diǎn)參與冬凌草甲素上調(diào)PLK1蛋白穩(wěn)定性。

圖8 PLK1蛋白突變后冬凌草甲素對(duì)PLK1穩(wěn)定性的影響Fig 8 Effect of oridonin on the stability of PLK1 after mutation

3 討論

近年來(lái)，用傳統(tǒng)中藥治療T-ALL，對(duì)其有效天然產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造及增效，正逐漸引起廣泛關(guān)注。來(lái)自中藥的天然產(chǎn)物因其不良反應(yīng)少、作用確切等諸多優(yōu)勢(shì)而成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)［7］。冬凌草甲素是冬凌草的有效活性成分，分子中與環(huán)外亞甲基共軛的環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)是發(fā)揮藥理作用的活性中心。冬凌草甲素對(duì)急性白血病、胰腺癌、乳腺癌等有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［8-11］，且其毒性低，對(duì)骨髓、肝、腎等無(wú)明顯損傷［12］，提示冬凌草甲素是較好的抗腫瘤候選藥物之一。

有研究［13］報(bào)道冬凌草甲素可通過(guò)抑制NF-κB通路或下調(diào)Brg1抑制Jurkat細(xì)胞增殖。Dal Piaz等［14］用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，在Jurkat細(xì)胞中，冬凌草甲素可以直接與Hsp70-1A結(jié)合并使之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而無(wú)法與下游靶標(biāo)結(jié)合，最終產(chǎn)生抗腫瘤作用。我們的研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，且低劑量冬凌草甲素誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

PLK1最早在黑腹果蠅的基因組中被發(fā)現(xiàn)，其蛋白水平和活性在細(xì)胞周期進(jìn)程中受到精確調(diào)控，在G1期幾乎檢測(cè)不到PLK1蛋白，在S期PLK1蛋白開(kāi)始累積，于G2末期達(dá)到峰值，M期維持高水平，分裂完成后急劇下降［15］。由于PLK1參與各種關(guān)鍵的細(xì)胞周期事件，因此被認(rèn)為是有效的癌癥治療藥物靶標(biāo)之一。我們發(fā)現(xiàn)低劑量冬凌草甲素誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞阻滯在有絲分裂期，由此我們猜測(cè)冬凌草甲素可能直接調(diào)控了有絲分裂相關(guān)的激酶。Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，BuBR1、BuB1、PLK1、Aurora A、Aurora B是評(píng)分最高的調(diào)控有絲分裂的蛋白激酶，且BuBR1、PLK1、Aurora A和Aurora B蛋白都能發(fā)生泛素化修飾降解，從而快速調(diào)控其在有絲分裂期中的蛋白量［16］。我們用冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可上調(diào)PLKl蛋白量且上調(diào)其活性，而另4種蛋白激酶的含量無(wú)變化，提示PLK1可能是冬凌草甲素的另一個(gè)作用靶點(diǎn)。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）可降解細(xì)胞內(nèi)超過(guò)80%的正常或異常蛋白質(zhì)，是一種具有高度特異性和選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑［17］，泛素化過(guò)程與幾乎所有細(xì)胞生理活動(dòng)相關(guān)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的異常調(diào)控會(huì)導(dǎo)致腫瘤等各種疾病的發(fā)生［18］。蛋白質(zhì)通過(guò)泛素化途徑降解或者通過(guò)抑制泛素化降解導(dǎo)致蛋白累積是快速調(diào)控蛋白水平的途徑，也是細(xì)胞周期進(jìn)程中調(diào)控細(xì)胞周期依賴性蛋白水平的重要方式。我們的研究不僅發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素處理Jurkat細(xì)胞24 h后PLK1蛋白含量始終維持高水平，且揭示冬凌草甲素可抑制PLK1蛋白的泛素化修飾，這可能是提高PLK1蛋白穩(wěn)定性的主要機(jī)制。

細(xì)胞裂解液中各不同靶蛋白都有各自獨(dú)特的熔解曲線。Martinez Molina等［19］將臨床藥物作用于細(xì)胞裂解液，發(fā)現(xiàn)如藥物可與靶蛋白結(jié)合，則可觀察到靶蛋白的熔解曲線發(fā)生明顯移動(dòng)，由此設(shè)計(jì)細(xì)胞熱力學(xué)遷移實(shí)驗(yàn)（celluar thermal shift assay，CETSA）。結(jié)合后形成的復(fù)合物會(huì)改變靶蛋白原來(lái)的熱穩(wěn)定性，使其在一定溫度范圍內(nèi)更穩(wěn)定或更容易降解，通過(guò)這種穩(wěn)定性的差異，我們可以判斷小分子化合物和靶蛋白能形成復(fù)合物［20-21］。CETSA的結(jié)果證明冬凌草甲素可與PLK1蛋白直接結(jié)合。雖然我們初步證實(shí)冬凌草甲素能和PLK1直接作用，但是我們也不排除冬凌草甲素通過(guò)抑制特異性泛素連接酶E3來(lái)抑制PLK1的泛素化修飾和降解。

為進(jìn)一步驗(yàn)證冬凌草甲素可與PLK1蛋白結(jié)合，我們通過(guò)定點(diǎn)突變的方法分別構(gòu)建PLK1蛋白氨基酸殘基Cys67、Cys133位 點(diǎn) 突 變 的pCMV-flag-PLK1-M1和pCMV-flag-PLK1-M2質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得外源性表達(dá)的突變型PLK1蛋白。CETSA結(jié)果顯示冬凌草甲素不再誘導(dǎo)Cys67或Cys133位點(diǎn)突變后的PLK1蛋白含量發(fā)生變化，提示Cys67或Cys133位點(diǎn)在冬凌草甲素與PLK1直接結(jié)合中起核心作用。我們繼續(xù)深入探索Cys67、Cys133位點(diǎn)對(duì)冬凌草甲素處理后PLK1蛋白穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)以上位點(diǎn)突變后可逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素誘導(dǎo)的PLK1泛素化修飾水平下調(diào)，提示冬凌草甲素與PLK1的直接結(jié)合受抑制，證實(shí)Cys67和Cys133位點(diǎn)是PLK1與冬凌草甲素結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

綜上所述，冬凌草甲素可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯以抑制細(xì)胞增殖。進(jìn)一步探究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可上調(diào)PLK1蛋白含量并通過(guò)直接與PLK1蛋白結(jié)合而抑制其泛素化降解，從而增強(qiáng)PLK1蛋白穩(wěn)定性。經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)PLK1蛋白的Cys67和Cys133位點(diǎn)是PLK1蛋白與冬凌草甲素結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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