付靜怡，汪雷，楊異

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院胸外科，上海200233

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是1994年由美國-歐洲共識會議委員會首次提出，由多種直接或間接因素（包括但不限于感染、創(chuàng)傷、中毒、休克、肺炎、輸血、免疫反應(yīng)等）導(dǎo)致氧合指數(shù)（oxygenation index，OI）≤300 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的概念，常常導(dǎo)致低氧血癥性呼吸衰竭甚至急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的 發(fā) 生［1-3］。ALI時(shí)，急性全身性炎癥反應(yīng)可引起微血管損傷，使肺血管和上皮的通透性增加，蛋白質(zhì)和富含炎性細(xì)胞的液體流入肺泡腔，導(dǎo)致非心源性肺水腫，氣體交換肺泡-毛細(xì)血管減少，進(jìn)而導(dǎo)致低氧性呼吸衰竭及ARDS［4-5］；臨床上表現(xiàn)為胸悶氣促、呼吸困難、進(jìn)行性低氧血癥，影像學(xué)上可表現(xiàn)為肺滲出性改變［1］。目前ALI的病死率仍相當(dāng)高，為29%～42%，且與致病因素有很大關(guān)系；敗血癥的病死率約為43%，肺炎和誤吸的病死率分別為36%和37%，重大創(chuàng)傷則為11%［6］。

雖然ALI的兇險(xiǎn)程度很大，但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制及治療措施進(jìn)展不大，因此建立動(dòng)物模型來模擬ALI很有必要。ALI的動(dòng)物模型建立，可依據(jù)其病因分為生物因素誘導(dǎo)的ALI模型、輸血模型、物理撞擊模型、呼吸機(jī)模型，以及缺血再灌注模型，此外還有缺氧模型、免疫反應(yīng)模型等。所用動(dòng)物最常用的為小鼠、大鼠、白兔等小動(dòng)物模型，也有狗、羊、豬等大動(dòng)物模型。本文就ALI的動(dòng)物模型建立方法進(jìn)行綜述。

1 ALI的誘導(dǎo)方法

1.1 生物因素誘導(dǎo)的ALI

在臨床上，膿毒血癥患者極易發(fā)生ALI，在膿毒血癥患者中ALI的發(fā)病率和病死率分別高達(dá)40.2%和30%～85%［7］，因此在ALI的動(dòng)物模型建立中，以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）為代表的生物因素誘導(dǎo)膿毒血癥致ALI是最常見的方法。

Zhang等［8］在其研究中就用到了LPS誘導(dǎo)小鼠ALI。他們選用7周齡的雄性小鼠，在小鼠8周齡時(shí)對其進(jìn)行處理：將小鼠吸入異氟醚進(jìn)行麻醉，實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)氣管注入20μg LPS及50μL無菌生理鹽水的混合溶液，對照組小鼠只注射50 mL無菌生理鹽水，觀察比較2組的肺損傷程度。Morales-Ortíz等［9］也使用了此方法：選用8～10周齡、體質(zhì)量20～23 g的小鼠。小鼠腹腔注射氯胺酮+甲苯噻嗪進(jìn)行麻醉，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別用10μg LPS及無菌磷酸鹽緩沖液滴鼻，比較2組肺損傷程度。Song等［10］使用狗來建立動(dòng)物模型，選用13.75～14.65 kg的雄性犬，對照組靜脈輸注0.9%的生理鹽水，肺損傷組先靜脈輸注0.9%的生理鹽水，30 min后靜脈注射LPS（1 mg/kg），10 min后再靜脈輸注0.9%的生理鹽水。而Passmore等［11］選擇了37～48 kg的3歲非孕母羊，麻醉后在4 h內(nèi)靜脈注射劑量遞增的LPS來誘導(dǎo)ALI。

1.2 輸血所致急性肺損傷動(dòng)物模型

輸血所致急性肺損傷（transfusion-related acute lung injury，TRALI）十分常見［6］。當(dāng)輸血后6 h內(nèi)急性發(fā)作，及OI＜300 mmHg，胸部X線攝片可見肺部雙側(cè)浸潤改變，無體液性肺水腫跡象，且無其他ALI危險(xiǎn)因素時(shí)，即可以高度懷疑TRALI［12-13］。

Vlaar等［14］曾建立過TRALI模型，供體鼠選擇250 g雄性大鼠，麻醉后使用含有檸檬酸鹽-磷酸-葡萄糖的注射器收集血液，離心分離出血小板以供輸注，在30 min內(nèi)向受體鼠輸注供體血液。而在Fung等［15］的研究中則利用非直接輸血的方法制造了小鼠TRALI模型。有文獻(xiàn)報(bào)道［16］單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）可誘導(dǎo)TRALI類似癥狀，實(shí)驗(yàn)選用6～12周的雄性小鼠，通過尾靜脈注射不同濃度混有mAb的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）模擬小鼠TRALI模型。

1.3 鈍性撞擊下的ALI動(dòng)物模型

臨床上創(chuàng)傷導(dǎo)致的ALI又稱肺挫傷。盡管其嚴(yán)重程度并不高，但其發(fā)病率相當(dāng)高，且患者往往合并肋骨骨折、全身多處骨折、胸腔積液、肺不張等合并癥。肺挫傷對患者的呼吸功能有一定影響［17］。因此，在ALI動(dòng)物模型的建立中，鈍性撞擊的模擬非常重要。

Kao等［18］的研究制造了鈍性胸部創(chuàng)傷（blunt chest trauma，BCT）的小鼠ALI模型，方法：將250～300 g的大鼠外周注射苯巴比妥鈉麻醉，取其仰臥位固定于平板上，四肢用膠帶固定，將一圓柱狀金屬分別從不同高度自由墜落至大鼠右胸側(cè)（防止心肌損傷）。Wang等［19］、Aksu等［20］采用同樣的方法制造鈍性胸部創(chuàng)傷模型。Smith等［21］利用槍擊制造肺挫傷模型，方法為選取體質(zhì)量40～50 kg的豬，麻醉后使用特制螺栓槍槍擊，模擬右側(cè)肺挫傷。

1.4 機(jī)械通氣導(dǎo)致ALI動(dòng)物模型

臨床常見使用呼吸機(jī)所致的ALI，因此有許多利用機(jī)械通氣誘導(dǎo)建立ALI動(dòng)物模型的方法［22］。López-Alonso等［23］使用此種方法：通過腹腔內(nèi)注射氯胺酮及甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，然后切開小鼠氣管進(jìn)行機(jī)械通氣，用2種不同水平的壓力［15 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）、100次/min和20 cmH2O、50次/min］分別誘導(dǎo)溫和及嚴(yán)重的ALI，并在開始時(shí)和2.5 h后進(jìn)行取樣研究。Neudecker等［24］的實(shí)驗(yàn)中也用了類似的方法：腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，切開氣管后將氣管插管連接機(jī)械呼吸機(jī)，使用45 cmH2O的高吸氣壓力持續(xù)3 h通入純氧，誘導(dǎo)ALI。Kreyer等［25］則用羊制造動(dòng)物模型，將非孕母羊麻醉后行氣管插管，容量控制模式下進(jìn)行呼吸機(jī)機(jī)械通氣從而誘導(dǎo)ALI。

1.5 缺血-再灌注所致ALI動(dòng)物模型

在肺移植、休克、肺栓塞、肺袖狀切除術(shù)后等情況下，ALI的發(fā)病率非常高，而其發(fā)病機(jī)制主要為肺的缺血-再灌注（ischemia reperfusion，IR），因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中缺血-再灌注模型是使用較多的一種方法。

在Chen等［26］的研究中使用了此類方法：選用體質(zhì)量20～25 g的小鼠，麻醉后對小鼠實(shí)施開胸手術(shù)，左肺門鉗夾1 h并松開，再灌注1 h。Jia等［27］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用類似方法：選用210～250 g的大鼠，通過外周注射戊巴比妥鈉麻醉，實(shí)驗(yàn)組對大鼠行開胸手術(shù)后將小鼠左側(cè)肺門夾緊1 h，再松開1 h，并觀察左肺的膨脹不張的程度，確保肺缺血再灌注的充分進(jìn)行；對照組只接受開胸手術(shù)并不進(jìn)行肺門夾閉。在Grimm等［28］的研究中，動(dòng)物模型選取3～5 kg的新西蘭家兔，麻醉后行右心室切開術(shù)，在肺主動(dòng)脈處插入一根輸入導(dǎo)管，在左心房處插入一根輸出導(dǎo)管，然后結(jié)扎上下腔靜脈和主動(dòng)脈，使心肌缺血，將兔進(jìn)行肝素化處理后經(jīng)右心室導(dǎo)管灌注300 mL自體血，左心房插管用于監(jiān)測血壓。

1.6 化學(xué)因素致ALI動(dòng)物模型

中毒、誤吸所致ALI在臨床也很常見。Patel等［29］使用鹽酸制造ALI小鼠模型：選用10～12周齡25～30 g的小鼠，腹腔麻醉后氣管內(nèi)注射等滲鹽酸溶液，再進(jìn)行肺損傷評估。Liu等［30］用家兔建立模型：選用2.7～3.2 kg的成年雄性家兔，靜脈注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，實(shí)驗(yàn)組氣管內(nèi)注射pH=1.5的鹽酸溶液誘導(dǎo)ALI，對照組只注射同等劑量的無菌生理鹽水。

1.7 其他因素致ALI動(dòng)物模型

缺氧所致ALI模型也有報(bào)道。Allard等［31］利用氯氣制造缺氧致ALI小鼠模型。Carnesecchi等［32］報(bào)道利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）缺陷的小鼠制造缺氧性ALI模型。Rangarajan等［33］使用博來霉素制造小鼠藥物致ALI模型。

2 ALI的評估方法

2.1 病理學(xué)評估

病理學(xué)觀察是判定肺損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)點(diǎn)在于取樣簡單，觀察評估簡便準(zhǔn)確；缺點(diǎn)在于只能將動(dòng)物處死后取材，可能因?yàn)榉螕p傷后活體動(dòng)物的病理表現(xiàn)存在一定的差異。模擬ALI的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)基本用此種方法，步驟為：處死動(dòng)物后將肺取出，利用石蠟制片及蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H-E staining）法將肺組織切片固定染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.2 炎性介質(zhì)濃度評估

支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）以及血清中炎性介質(zhì)含量是除病理學(xué)外用到最多的評估肺損傷嚴(yán)重程度的方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肺損傷嚴(yán)重程度與各種炎性介質(zhì)如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞因子計(jì)數(shù)密切相關(guān)。當(dāng)ALI時(shí)，中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的募集浸潤，各種炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β）、炎性小體域蛋白3（recombinant NLR family，pyrin domain containing protein 3，NLRP3）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等以及肺泡細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)等的釋放均起到了重要作用［34-37］。

通過重復(fù)注射及回抽PBS緩沖液收集BALF，或者直接留取血清樣品進(jìn)行測定。在經(jīng)過離心固定等操作后進(jìn)行巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過酶聯(lián)免疫吸附測定和蛋白質(zhì)印跡法分析IL-1β、NLRP3、NF-κB等指標(biāo)的濃度，以及通過蛋白電泳等方法計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

2.3 微計(jì)算機(jī)斷層掃描成像

微計(jì)算機(jī)斷層掃描成像（micro-computed tomography，微CT）是評估ALI的一種常用方法，具有快速、無創(chuàng)、連續(xù)的體內(nèi)成像功能，是研究小鼠肺部病理變化的強(qiáng)大工具［38］。使用微CT對小鼠肺部進(jìn)行體內(nèi)成像，不僅可以在不干擾組織的情況下進(jìn)行更完整的分析，還可以最大限度地減少數(shù)據(jù)插值的需要［39］，且CT影像學(xué)在臨床中應(yīng)用較廣、較便捷，因此這種方法在臨床上的可操作性較高，不足之處在于需要一定的技術(shù)支持。

2.4 肺干/濕比

肺干/濕比（dry/wet ratio）可以用來評估肺水腫的嚴(yán)重程度。方法為：動(dòng)物死亡時(shí)取全肺稱重，確定濕重；置于烘箱中烘干后稱重，確定干重；計(jì)算干/濕比。

2.5 血?dú)夥治?/h3>

由于肺損傷時(shí)通氣血流比例失衡，氧結(jié)合能力下降，動(dòng)脈血氧分壓下降，因此血?dú)夥治觯╞lood gas analysis，BGA）可以作為評估肺損傷程度的重要指標(biāo)。

2.6 肺泡液體清除率

用肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance，AFC）評估肺損傷程度的報(bào)道較少。Patel等［29］報(bào)道，在15 min內(nèi)需完成操作：誘導(dǎo)ALI后處死小鼠，在小鼠氣管內(nèi)注射含有熒光標(biāo)記牛血清白蛋白的等滲液再重復(fù)回抽。計(jì)算AFC百分比：［1-（F0/F30）］×100%，其中F0是時(shí)間t=0時(shí)參照樣品中含有熒光標(biāo)記的蛋白濃度，F(xiàn)30是t=30 min時(shí)含有熒光標(biāo)記樣品的濃度。這種方法操作復(fù)雜，可操作性較低，一般不常用。

3 ALI的評估結(jié)果

通過比較模型組及對照組的肺損傷指標(biāo)，可以得出：①肺損傷組的肺組織病理學(xué)表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)性水腫、肺泡壁厚度增加、中性粒細(xì)胞數(shù)量增多、肺組織斑塊狀出血。其病理學(xué)表現(xiàn)隨損傷程度加重而更加明顯。②炎性指標(biāo)是除病理學(xué)診斷外最常用的指標(biāo)。多種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在ALI時(shí)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞募集增多，在傷后48 h后最為敏感；各種炎癥因子如IL-1β、NLRP3、NF-κB、HIF-1α、TNF-α等均有不同程度的升高，其中尤以IL-1β最為敏感；而肺泡細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)濃度也可以作為評估肺損傷程度的指標(biāo)。③微CT掃描顯示急性肺損傷動(dòng)物肺密度較對照組明顯增加，肺三維重建圖像可以生動(dòng)地顯示出肺損傷的區(qū)域和程度，可以看出ALI動(dòng)物的肺容量明顯減少。④肺水腫是肺損傷時(shí)的重要表現(xiàn)之一，肺損傷組的肺干/濕比顯著降低，且肺損傷程度越高，肺干/濕比越低。⑤在肺損傷時(shí)，動(dòng)脈血氧分壓可有不同程度的下降。但其結(jié)果受影響因素較多，因此只能作為參考而不是診斷的指標(biāo)。⑥當(dāng)肺泡損傷時(shí)，AFC可下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFC在傷后前2 d呈顯著下降趨勢，在傷后第二天到達(dá)最低點(diǎn)，而后可緩慢升高。

4 總結(jié)

綜上所述，ALI作為胸外科及呼吸科常見的危急疾病之一，其發(fā)病率和病死率均相當(dāng)高，如不及時(shí)處理，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)ARDS甚至死亡。因此，建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍MALI并進(jìn)一步研究肺損傷發(fā)病的分子機(jī)制、治療干預(yù)措施等實(shí)驗(yàn)，對ALI的早期診斷和治療有很大幫助。

近年來的研究報(bào)道表明ALI的動(dòng)物模型建立方法已初步成型，根據(jù)其病因可分為：以LPS為主的生物因素模擬全身感染，間接導(dǎo)致炎性反應(yīng)性ALI；輸血因素先引發(fā)機(jī)體自身免疫反應(yīng)，繼而引發(fā)ALI；物理鈍性撞擊則通過外力作用直接導(dǎo)致ALI；機(jī)械通氣可直接導(dǎo)致肺泡破裂、肺毛細(xì)血管通透性增加，引起ALI；缺血-再灌注模型也可直接誘導(dǎo)肺血管的缺血-再灌注，直接導(dǎo)致ALI的發(fā)生；化學(xué)因素直接作用于呼吸系統(tǒng)導(dǎo)致的ALI等。其中，化學(xué)因素所致ALI程度最嚴(yán)重，動(dòng)物模型病死率極高；輸血導(dǎo)致的自身免疫性ALI程度一般較輕；而其他因素受干預(yù)因素的劑量影響較大，無法進(jìn)行ALI程度上的橫向?qū)Ρ取?/p>

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法選取，如化學(xué)因素模型多以20～50 g小鼠為主，鈍性撞擊模型則多以200～300 g大鼠或大動(dòng)物模型為主。幼年及老年動(dòng)物對損傷的耐受性較差，因此所選動(dòng)物均為成年動(dòng)物，如小鼠一般為7～10周齡。尚未有研究表明所選動(dòng)物的性別、品系對實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在影響。

麻醉方法多為腹腔內(nèi)麻醉，也可使用肌內(nèi)注射、吸入麻醉等方法。麻醉藥物以氯胺酮及甲苯噻嗪、巴比妥類及異氟醚較常用。

評估肺損傷程度可使用組織病理學(xué)、肺泡灌洗液及血液中炎性介質(zhì)濃度、微CT成像、血?dú)夥治觥⒎胃?濕比、肺泡液體清除率等方法。其中，病理學(xué)、肺干/濕比評估方法需取樣肺組織，因此只能適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床上幾乎沒有可實(shí)施性。微CT成像在臨床上可實(shí)施性較大，且操作便捷，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中技術(shù)尚不完全成熟，實(shí)驗(yàn)誤差無法避免。血?dú)夥治鍪芨蓴_因素較多，結(jié)果參考意義不大。肺泡液體清除率操作復(fù)雜，不便于實(shí)施。炎性介質(zhì)濃度測定較方便，結(jié)果有意義，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及流程上可操作性空間均較大，因此可作為建模的重要指標(biāo)。

外傷所致ALI（肺挫傷）的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道，但肺挫傷在臨床上的發(fā)病率較高且致命，其發(fā)病機(jī)制及治療措施尚未明確。未來可參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法并加以優(yōu)化，對肺挫傷的病理生理及治療干預(yù)措施進(jìn)行深入研究。

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