李海軍，邊 沁，何先偉

四川省廣元市中心醫(yī)院檢驗科，四川廣元 628000

子宮內(nèi)膜癌為原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，具有發(fā)病因素多、機制尚不明確的特點，有研究報道其病死率已居惡性腫瘤的前10位[1]。近年一些學者探討了子宮內(nèi)膜癌前病變與子宮內(nèi)膜癌的關系，發(fā)現(xiàn)細胞免疫水平與疾病密切相關，考慮通過評估T淋巴細胞及腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs)相關分子標志物的表達水平來防治子宮內(nèi)膜癌前病變的惡性發(fā)展[2-3]。TILs參與腫瘤微環(huán)境組成和局部免疫應答，既往研究已證實TILs表達水平影響癌癥化療效果，考慮與相關標記抗體對臨床指標的影響有關[4]。腫瘤細胞浸潤后T淋巴細胞活化程度增加，程序性死亡因子1(PD1)表達上調(diào)，與程序性死亡配體1(PD-L1)相互作用后誘導T淋巴細胞凋亡，進而下調(diào)機體抗腫瘤免疫應答。另外，近年以PD-L1為靶點的治療藥物已在乳腺癌患者中得到應用[5]。但目前關于TILs標記抗體CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展關系的報道較少，且尚缺乏臨床數(shù)據(jù)支持。因此，本研究就此展開討論，明確子宮內(nèi)膜癌前病變惡性發(fā)展的預測因子，以期為子宮內(nèi)膜癌防治提供新的預測依據(jù)和治療靶點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月至2018年12月本院96例子宮內(nèi)膜癌患者納入子宮內(nèi)膜癌組，68例子宮內(nèi)膜正常女性納入正常子宮內(nèi)膜組。子宮內(nèi)膜癌患者年齡26～60歲，平均(42.25±4.14)歲，<49歲38例，≥49歲58例；病理學分級G1～G2級45例，G3級51例；國際抗癌聯(lián)盟分期Ⅰ期42例，Ⅱ～Ⅲ期54例；有淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移74例；正常子宮內(nèi)膜來源女性年齡28～56歲，平均(41.85±4.08)歲，<49歲42例，≥49歲26例。子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，有可比性。入選標準：(1)經(jīng)病理學檢查確診；(2)子宮發(fā)育正常的女性；(3)年齡18～65歲；(4)入院前均未接受放療、化療或靶向治療；(5)未發(fā)生全身其他部位轉移；(6)卡氏( KPS)評分≥70分；(7)預計生存期超過1年。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)依從性差，不能定期隨訪；(3)有乳腺癌既往史；(4)過敏體質(zhì)或凝血功能異常；(5)溝通障礙或嚴重精神疾病；(6)臨床資料不完整，相關檢查不完善；(7)未完成治療；(8)因疾病惡化或出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥需進行其他治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會討論并通過，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方法 采用RM2235組織切片機(德國徠卡)將所有包蠟組織切成4 μm連續(xù)切片，依次采用二甲苯(南通新能源物資有限公司)、枸櫞酸鈉緩沖液(北京泰澤瑞達科技有限公司)及3%過氧化氫溶液(北京百歐博偉生物技術有限公司)進行脫蠟、抗原修復、梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海穎心實驗室設備有限公司)漂洗，內(nèi)源性過氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人PD1、PD-L1、CD8、CD68、FoxP3多克隆抗體(濃度1∶100，購自美國Santa Cruz公司)4 ℃孵育過夜；PBS漂洗，滴加即用型生物素化二抗37 ℃孵育30 min；PBS漂洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS漂洗，經(jīng)DAB顯色試劑盒(Solarlaio)顯色，蘇木精(湖南匯百侍生物科技有限公司)復染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹脂(南京森貝伽生物科技有限公司)封片，DMM-440倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)下觀察CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1表達。

1.3染色判定標準 由兩名具有執(zhí)業(yè)資格的病理科醫(yī)生采用雙盲法對結果進行判斷和分析：每張切片中選取癌細胞數(shù)較多的5個高倍視野(SP，×400)，每個視野計數(shù)100個細胞；染色強度：0分為不著色，1分為淡黃色，2分為深黃色，3分為棕黃色；陽性細胞百分率：1分為陽性細胞百分率0～30%，2分為陽性細胞百分率>30%；兩項之和進行綜合判定：PD1、PD-L1表達量0～1分判定為-，2～6分判定為+[6]；CD8、CD68、FoxP3表達量≤3分判定為-，>3分判定為+[7]。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，組間有序分類資料比較采用Ridit分析；采用Kendall′s tau-b法對等級資料進行相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1CD8、CD68、FoxP3在TILs細胞上的表達情況 CD8、CD68主要定位于TILs細胞膜上，F(xiàn)oxP3主要定位于TILs細胞核上，為棕黃色顆粒，CD8、CD68、FoxP3在正常子宮內(nèi)膜組織中呈強陽性表達，見圖1。子宮內(nèi)膜癌組織中CD8、CD68、FoxP3陽性率分別為33.33%(32/96)、36.46%(35/96)、37.50%(36/96)，明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織中CD8、CD68、FoxP3陽性率[64.71%(44/68)、70.59%(48/68)、67.65%(46/68)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2PD1、PD-L1在TILs及T淋巴細胞上的表達情況 PD1、PD-L1主要定位于細胞膜或(和)細胞質(zhì)上，為棕黃色顆粒；PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌組織中TILs及T淋巴細胞上均呈陽性表達，見圖2、3。子宮內(nèi)膜癌組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率分別為 34.38%(33/96)、36.46%(35/96)，高于正常子宮內(nèi)膜組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率[14.71%(10/68)、20.59%(14/68)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。子宮內(nèi)膜癌T淋巴細胞上的PD1、PD-L1陽性率分別為16.67%(16/96)、19.79%(19/96)，與正常子宮內(nèi)膜組織T淋巴細胞上的PD1、PD-L1陽性率[17.65%(12/68)、16.18%(11/68)]比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：A1為正常子宮內(nèi)膜CD8表達;A2為子宮內(nèi)膜癌CD8表達;B1為正常子宮內(nèi)膜 CD68表達；B2為子宮內(nèi)膜癌CD68表達；C1為正常子宮內(nèi)膜FoxP3表達;C2為子宮內(nèi)膜癌FoxP3表達。

注：A1為正常子宮內(nèi)膜PD1表達；A2為子宮內(nèi)膜癌PD1表達；B1為正常子宮內(nèi)膜PD-L1表達；B2為子宮內(nèi)膜癌PD-L1表達。

注：A1為正常子宮內(nèi)膜PD1表達；A2為子宮內(nèi)膜癌PD1表達；B1為正常子宮內(nèi)膜PD-L1表達；B2為子宮內(nèi)膜癌PD-L1表達。

2.3子宮內(nèi)膜癌患者PD1、PD-L1在TILs與T淋巴細胞上表達的相關分析 子宮內(nèi)膜癌患者PD1、PD-L1在TILs與T淋巴細胞上的陽性率無關(P>0.05)。見表1。

2.4CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1與子宮內(nèi)膜癌患者年齡及臨床病理特征的關系 CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1在病理學分級G3、有淋巴結轉移子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性率高于在病理學分級G1～G2、無淋巴結轉移子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 PD1、PD-L1在TILs與T淋巴細胞上表達的相關分析(n)

表2 CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1與子宮內(nèi)膜癌患者年齡及臨床病理特征的關系(n)

項目nPD1(+)χ2PPD-L1(+)χ2P年齡(歲)1.241<0.050.658<0.05 <49381513 ≥49581822病理學分級6.520<0.056.021<0.05 G1～G24556 G3512829腫瘤分期3.025<0.050.424<0.05 Ⅰ421316 Ⅱ～Ⅲ542019淋巴結轉移4.025<0.055.201<0.05 有221819 無74516

3 討 論

PD1、PD-L1可相互作用，共同對T淋巴細胞活性產(chǎn)生抑制，T淋巴細胞正常傳遞和激活功能下降后，可抑制腫瘤免疫機制進而形成腫瘤微環(huán)境。二者在細胞組織中表達，具有影響細胞黏附、生長、凋亡、增殖、炎性反應、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能。王鈺聰?shù)萚8]發(fā)現(xiàn)，PD1、PD-L1在非小細胞肺癌細胞質(zhì)或細胞質(zhì)基質(zhì)中表達上調(diào)時，患者5年生存率更低。DURUISSEAUX等[9]采用抗PD1、PD-L1的人源化單克隆抗體治療肺癌后發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞功能和肺癌耐藥性均明顯升高，提示PD1、PD-L1可誘導癌細胞耐藥。以上研究表明，PD1、PD-L1可促進腫瘤細胞發(fā)展。目前，抗PD1、PD-L1的人源化單克隆抗體已獲得批準用于治療轉移性尿路上皮癌及三陰性乳腺癌等，藥物安全性試驗結果表明，當PD1、PD-L1陽性表達時治療客觀緩解率更高[10]。因此，推測進行PD1、PD-L1表達的監(jiān)測對于疾病發(fā)展的預測有重要價值。本研究結果顯示，PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌組織中TILs及T淋巴細胞上均呈陽性表達，且子宮內(nèi)膜癌組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率。進一步分析二者與子宮內(nèi)膜癌病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)當PD1、PD-L1陽性率升高時，病理分級越高，更易發(fā)生淋巴結轉移。這與國內(nèi)學者田大偉等[11]的研究結果基本一致，PD1、PD-L1可促進腫瘤細胞生長和增殖。另外，本研究中PD1、PD-L1陽性率低于PRAT等[12]的報道，考慮與本研究樣本量較少有關。

TILs包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK 細胞，當T淋巴細胞通過激活而聚集后可刺激PD1/PD-L1途徑逃脫免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞。本研究中CD8、CD68、FoxP3和PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌中均呈陽性表達。另外，T淋巴細胞中PD1、PD-L1陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明T淋巴細胞中的PD1、PD-L1表達數(shù)量并不能決定癌癥的發(fā)生和發(fā)展。沈輝等[13]的研究結果顯示，TILs比例較高的乳腺癌患者經(jīng)化療或分子靶向治療后，高TILs表達患者無病生存期高于低TILs表達患者。ZHU等[14]的研究指出，CD8、CD68、FoxP3在膀胱癌組織切片中陽性率低于正常膀胱組織。本研究結果顯示，CD8、CD68、FoxP3陽性率越高，病理分級越高，且存在淋巴結轉移，與上述研究結果一致。分析其作用機制可得，腫瘤患者在接受化療藥物治療后，腫瘤細胞會釋放出腫瘤相關抗原，從而觸發(fā)對腫瘤細胞免疫應答反應。CD68為一類可檢測人體組織中巨噬細胞的分子標記物，可調(diào)節(jié)巨噬細胞浸潤導致的血管新生、癌浸潤深度、病理分期等的發(fā)展。CD8、CD68、FoxP3高表達與腫瘤細胞的免疫應答反應相關，可促進腫瘤細胞壞死，進而提高治療客觀緩解率。李國等[15]的研究結果顯示，向機體回輸CD8+T淋巴細胞型細胞因子后，腫瘤微環(huán)境中CD4+TILs抗腫瘤作用增強。

綜上所述，PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達，而CD8、CD68、FoxP3呈低表達，且與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征關系密切，考慮可通過人為干預治療改變PD1、PD-L1比例，增強患者免疫調(diào)節(jié)能力，為治療子宮內(nèi)膜癌提供新的策略依據(jù)。但由于研究時間短，本研究未對患者的長期生存率進行分析，暫不能明確PD1、PD-L1靶向治療藥物的有效性，關于PD1、PD-L1靶向治療藥物的應用和開展仍需在臨床中進一步探討。