李 黎，唐李鳳，鐘雪梅，任 杰，張素杰，何川疆，鄒小廣△，許愛敏▲

1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆喀什 844000；2.石河子大學(xué)，新疆石河子 832000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種可防、可治的常見病[1]。我國(guó)COPD的疾病負(fù)擔(dān)重，患病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。COPD病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受環(huán)境和遺傳因素共同影響[3]。目前，研究結(jié)果表明COPD的分子發(fā)病機(jī)制主要是氣道炎性反應(yīng)，且氧化應(yīng)激可促使炎性反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)[4]。Nrf2的激活是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵，它可調(diào)節(jié)多個(gè)抗氧化酶來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性與COPD易感性有關(guān)，圍繞Nrf2遺傳變異的研究可能開辟未來(lái)治療COPD的重要途徑[6]，然而，關(guān)于Nrf2基因多態(tài)性與維吾爾族人群COPD的相關(guān)性研究報(bào)道較少。本研究旨在評(píng)估Nrf2基因位點(diǎn)rs35652124、rs6721961單核苷酸多態(tài)性(SNP)與維吾爾族人群COPD易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月在新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院接受治療的203例COPD患者作為病例組，COPD的診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診斷、治療與預(yù)防全球倡議》(GOLD)標(biāo)準(zhǔn)[1]。同期選擇新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院199例維吾爾族體檢健康者作為對(duì)照組，均滿足以下條件:(1)胸部CT檢查結(jié)果顯示無(wú)器質(zhì)性病變；(2)肺功能正常，第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1% Pred)>80%，吸入400 μg沙丁胺醇30 min后第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比(FEV1/FVC)>70%。所有研究對(duì)象均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)排除與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病，如支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、肺間質(zhì)纖維化、結(jié)節(jié)病、支氣管哮喘、糖尿病、心臟病等；(2)排除有各系統(tǒng)腫瘤病史；(3)均為維吾爾族，至少3代長(zhǎng)期居住于喀什地區(qū)，各研究對(duì)象之間無(wú)任何血緣關(guān)系，且無(wú)外族通婚史。本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集所有研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血，使用Greiner 基因組DNA提取試劑盒(德國(guó)，Greiner)按照說(shuō)明書步驟從全血標(biāo)本中提取DNA。

1.2.2SNP選擇 使用Sequenom公司Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design軟件設(shè)計(jì)待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，并送至中國(guó)上海天昊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。

1.2.3基因檢測(cè) 采用多重PCR技術(shù)，在以下反應(yīng)條件下擴(kuò)增所選位點(diǎn)的基因序列：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸3 min；然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶處理以除去反應(yīng)中的dNTPs，再經(jīng)過單堿基延伸引物(約20 bp)擴(kuò)增SNP位點(diǎn)及樹脂純化，最后采用Sequenom-MassARRAY SNP技術(shù)進(jìn)行SNP分型檢測(cè)[7]。

表1 Nrf2基因多態(tài)性位點(diǎn)引物序列

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 分別對(duì)兩組研究對(duì)象中所檢測(cè)到的Nrf2基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs6721961、rs35652124)的基因型分布頻率進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩個(gè)位點(diǎn)的基因分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2病例組與對(duì)照組基線資料比較 病例組與對(duì)照組在性別、BMI、吸煙、動(dòng)物粉塵暴露方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組間年齡、SI、FEV1%Pred、用力肺活量占預(yù)計(jì)值百分比(FVC%Pred)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3兩組Nrf2基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因分布頻率比較 病例組與對(duì)照組rs6721961(G/T)、rs35652124(C/T)的基因型和等位基因分布頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組的基線資料比較

表3 兩組Nrf2基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

基因位點(diǎn)nrs6721961GGGTTTGT對(duì)照組199105(52.8)86(43.2)8(4.0)296(74.4)102(25.6)病例組203124 (61.1)71(35.0)8(3.9)319(78.6)87(21.4)χ2-2.9680.104-1.971OR(95%CI)-0.699(0.465～1.051)0.847(0.307～2.334)-0.791(0.571～1.097)P-0.0850.748-0.160

2.4多因素Logistic回歸分析 在校正性別、年齡、吸煙等混雜因素后，結(jié)果顯示rs35652124、rs6721961位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率與COPD的關(guān)系差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析

續(xù)表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

氧化應(yīng)激損傷和抗氧化防御機(jī)制在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，Nrf2是維持肺組織增生和存活最重要的抗氧化分子之一[8]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，位于細(xì)胞質(zhì)的Nrf2分子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，促進(jìn)抗氧化劑基因表達(dá)[9]，進(jìn)而發(fā)揮穩(wěn)定抗氧化作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 表達(dá)下調(diào)可能是COPD發(fā)病的重要原因之一，激活Nrf2表達(dá)可能是未來(lái)治療COPD的重要途徑[10]。

SNP是人類遺傳變異最常見的來(lái)源，當(dāng)關(guān)鍵區(qū)域突變時(shí)可能會(huì)影響基因功能。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已開展多項(xiàng)關(guān)于Nrf2啟動(dòng)子區(qū)域SNP與COPD易感性的研究。例如，美國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2啟動(dòng)子區(qū)域的rs6721961(C/C)與極低出生體質(zhì)量(VLBW)新生兒重度支氣管肺發(fā)育不良(BPD)風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[11]，而事實(shí)上幼年時(shí)期肺發(fā)育不良是COPD的重要危險(xiǎn)因素之一[12]。此前，國(guó)內(nèi)針對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs6721961位點(diǎn)與COPD遺傳易感性不相關(guān)[13]。但周小果[14]的研究卻發(fā)現(xiàn)，rs6721961(C/A)的A等位基因頻率是我國(guó)漢族COPD的危險(xiǎn)因素。此外，Nrf2啟動(dòng)子區(qū)域的rs35652124位點(diǎn)也顯示出與氧化應(yīng)激性疾病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，俄羅斯最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，rs35652124位點(diǎn)SNP是吸煙人群COPD的危險(xiǎn)因素，該位點(diǎn)AA基因型與FEV1明顯相關(guān)[15]。有趣的是，本研究證實(shí)Nrf2啟動(dòng)子區(qū)基因位點(diǎn)rs35652124(C/T)、rs6721961(G/T)SNP與COPD的關(guān)系差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究強(qiáng)調(diào)了不同人群COPD易感性的遺傳異質(zhì)性。

本研究是首次在維吾爾族人群中進(jìn)行Nrf2基因多態(tài)性與COPD相關(guān)性的研究，由于樣本地理來(lái)源的局限性，研究結(jié)果僅表明這兩個(gè)基因位點(diǎn)在喀什地區(qū)維吾爾族人群中存在差異。但由于本研究樣本有限，結(jié)果可能存在偏差。鑒于本研究得到的陰性結(jié)果，未來(lái)的研究將增加樣本量以充分了解更多的遺傳異質(zhì)性。

綜上所述，本研究顯示Nrf2啟動(dòng)子區(qū)基因位點(diǎn)rs35652124和rs6721961SNP與維吾爾族人群COPD發(fā)病無(wú)關(guān)，表明遺傳與環(huán)境等因素共同影響著COPD的發(fā)生、發(fā)展，基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性因地域或種族不同而存在一定差異，有待進(jìn)一步深入研究。