趙 爽 孫靜莉

中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧沈陽(yáng) 110003

卵巢癌是世界上最致命的婦科惡性腫瘤之一，全球每年死亡人數(shù)超過(guò)14 萬(wàn)人[1]。早期卵巢癌患者5 年生存率約為90%[2]。但是，約為70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，且預(yù)后較差[3]。卵巢癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、放療及化療，雖然近些年的醫(yī)療技術(shù)水平飛速提高，但是卵巢癌的總體生存率并未得到明顯提高[4]。微小RNA（miRNA）是一類小型非編碼RNA分子，在植物、動(dòng)物和病毒中均有表達(dá)。大約由22 個(gè)核苷酸組成，并具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，miRNA 在各種生物學(xué)過(guò)程中起到了重要作用，比如細(xì)胞增殖、凋亡、分化和遷移。提示，miRNA可作為多種疾病潛在的生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)[8]。miR-410 是一種新型miRNA，在多種癌癥中均低表達(dá)，如宮頸癌等[9]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，miR-410 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及侵襲、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基因再編輯等[10]。細(xì)胞周期蛋白B（cyclin B，CCNB1）蛋白包括6 個(gè)亞型，即cyclin B1～B6。CCNB1 是細(xì)胞生長(zhǎng)周期的重要調(diào)控因子，長(zhǎng)度約為8.8 kb。有文獻(xiàn)顯示[11]，CCNB1 在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞染色體形成、細(xì)胞增殖及分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。CCNB1 在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，如肝癌等[12]。相關(guān)文獻(xiàn)顯示[13]，miR-410 與CCNB1在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)可能呈負(fù)相關(guān)，但兩者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制的研究仍知之甚少。因此，本研究分析miR-410 與CCNB1 在卵巢癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理資料之間的關(guān)系，為患者治療及提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月—2020 年2 月于中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院住院治療的卵巢癌患者83 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)活檢病理或術(shù)后病理檢查明確診斷為卵巢癌；②所選研究對(duì)象均為首次診斷卵巢癌；③臨床資料完整，患者已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有同系統(tǒng)其他相關(guān)疾病者；②患有重要臟器疾病者，如冠心病等；③患有其他惡性腫瘤者；④接受過(guò)治療者。

1.2 方法

收集活檢或術(shù)中獲取的卵巢癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm，經(jīng)病理證實(shí)），冷凍保存并立即送檢。取100 mg 組織標(biāo)本，應(yīng)用TRIzol法提取總RNA（試劑盒購(gòu)自Biosharp 公司，貨號(hào)：20160911），使用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度，符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA 凍存?zhèn)溆?。使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司，貨號(hào)：20160604）將提取出的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，U6 用作內(nèi)部參考。反應(yīng)條件：37℃60 min，95℃5 min。反應(yīng)體系：1 μL dNTP，1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，2 μL 10×RT 緩沖液，0.5 μL RNase 抑制劑，1 μL RNA，3 μL miRNA-155/ U6 RT 引物，用NF H2O 補(bǔ)足體系至20 μL。qPCR 反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA 聚合酶，1 μL miRNA-155/U6 RT 產(chǎn)物和8 μL H2O。CCNB1 F：5’-TTGGGGACATTGGTAACAAAGTC-3’，R：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTTTT-3’；內(nèi)參U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-410 F：5’-CCGCACGATATAACACAGATG-3’，R:5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH F：5’ -GGTGAAGGTCGGAGTCAACG -3’，R：5’-CAAAGTTGTCATGGATGATCC-3’；最后結(jié)果以2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化miR-410 與CCNB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織與癌旁組織中miR-410 與CCNB 1 mRNA 的表達(dá)情況比較

卵巢癌組織中miR-410 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織（P ＜0.05）。卵巢癌組織中CCNB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 卵巢癌組織中miR-410 與CCNB1 mRNA 與臨床病理資料之間的關(guān)系

卵巢癌組織中miR-410 的相對(duì)表達(dá)量在腫瘤FIGO Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤浸潤(rùn)深度T3+T4、細(xì)胞分化低～中分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)低于在腫瘤FIGO Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤浸潤(rùn)深度T1+T2、細(xì)胞分化高分化及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而CCNB1 的相對(duì)表達(dá)量在腫瘤FIGO Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤浸潤(rùn)深度T3+T4、細(xì)胞分化低～中分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移于高于腫瘤FIGO Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤浸潤(rùn)深度T1+T2、細(xì)胞分化高及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P ＜0.05）；二者相對(duì)表達(dá)量在患者不同年齡及腫瘤直徑中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 卵巢癌組織中miR-410 與CCNB1 mRNA 與臨床病理資料之間的關(guān)系

2.3 卵巢癌組織中miR-410 與CCNB1mRNA 的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-410 與CCNB 1 mRNA 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.605，P ＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 卵巢癌組織中miR-410 與CCNB1 mRNA 的相關(guān)性

3 討論

卵巢癌的臨床癥狀主要有月經(jīng)不調(diào)、乏力、進(jìn)行性消瘦等，當(dāng)危及到其他器官時(shí)，嚴(yán)重者可危及生命，其發(fā)病率僅低于宮頸癌[2]。卵巢癌的發(fā)病原因尚不明確，可能與家族遺傳史及內(nèi)分泌不調(diào)有關(guān)。多數(shù)卵巢癌患者被診斷時(shí)已是晚期，預(yù)后較差，并且存在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]，隨著醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)的提高，研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA 和基因在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)影響細(xì)胞增殖及分化進(jìn)而調(diào)控腫瘤組織的生長(zhǎng)[14]。因此，迫切需要闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以確定關(guān)鍵的生物標(biāo)志物并開(kāi)發(fā)有效的靶向治療。

許多研究表明，miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)影響靶基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響蛋白的差異表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、代謝等過(guò)程具有一定的調(diào)節(jié)作用[15-17]。異常表達(dá)的miRNA可影響多種生物學(xué)過(guò)程，如血管形成、癌基因的激活等[18-19]。miR-410 是近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn)，有研究顯示miR-410 可通過(guò)調(diào)節(jié)ERLIN2 和ERS 的表達(dá)，進(jìn)而影響抑制乳腺癌的生長(zhǎng)過(guò)程[20]。本研究顯示，miR-410的異常表達(dá)與腫瘤分期、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，初步提示低表達(dá)的miR-410 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲等病理過(guò)程中發(fā)揮作用。簡(jiǎn)躍等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卵巢上皮細(xì)胞中miR-410 低表達(dá)，且miR-410 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力具有抑制作用，這與本研究結(jié)果具有一致性?？赡苁且?yàn)閙iR-410 可抑制dickkopf 相關(guān)蛋白1（DKK-1）的表達(dá)，沉默其在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的生物學(xué)功能，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤凋亡，最終抑制了腫瘤組織的生長(zhǎng)[21]。另一方面，miR-410可通過(guò)下調(diào)凋亡基因B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）和電壓依賴性陰離子通道（VDAC）的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，減少了腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)量，進(jìn)一步對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)提供了有利條件，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖及分化能力，使得腫瘤的惡性度進(jìn)一步加重[22]。

1983 年，cyclin 首次被發(fā)現(xiàn)，cyclin 包括10 類，其中CCNB1 為cyclin 的一個(gè)亞型，CCNB1 基因長(zhǎng)約8.8 kb，由9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子組成，蛋白分子質(zhì)量為62 Ku[23]。研究證明，CCNB1 在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞染色體積聚及細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用[24]。CCNB1 的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有聯(lián)系，CCNB1 可以通過(guò)下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，使得癌細(xì)胞黏附性降低，加速癌細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn)過(guò)程[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1 mRNA 的異常表達(dá)與腫瘤FIGO 分期、細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，初步顯示CCNB1參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。相關(guān)研究結(jié)果表明，當(dāng)CCNB1 與細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白酶結(jié)合后，產(chǎn)生大量的細(xì)胞成熟促進(jìn)因子，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)周期G1/S 期到G2/M 期，加速了細(xì)胞的有絲分裂的速度，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖及分化，加速了腫瘤的生長(zhǎng)速度，提高了腫瘤的惡性程度[26]。此外，高表達(dá)的CCNB1 可下調(diào)p53 基因的表達(dá)，使得基因組的穩(wěn)定性下降，為腫瘤細(xì)胞的惡性增殖提供了有利條件，并抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，促使細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[27-28]。

本研究中miR-410 與CCNB1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，原因可能是CCNB1 是miR-410 的靶基因，并且miR-410 可以促進(jìn)E-鈣黏蛋白的表達(dá)進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程起到一定的抑制作用，而CCNB1 卻抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，對(duì)腫瘤的惡性分化及轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[25]，但是兩指標(biāo)的具體作用機(jī)制還需在后續(xù)細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，卵巢癌組織中miR-410 及CCNB1 的異常表達(dá)與腫瘤FIGO 分期、細(xì)胞分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，共同參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，有望成為新的卵巢癌診治的分子標(biāo)志物。但兩者在卵巢癌的發(fā)生過(guò)程中的具體作用機(jī)制還需要大樣本多中心的研究來(lái)深入考究。