鄭少烈， 李若玢， 高綠芬， 高雪松， 李囡， 王曉玉

(暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510632)

卵巢癌的復(fù)發(fā)耐藥問題，一直是影響患者生存期及生活質(zhì)量的主要原因.細胞周期阻滯能夠促進突變DNA的修復(fù)以及異常細胞分裂的逆轉(zhuǎn)，為人體惡性腫瘤的重要監(jiān)控機制之一.p53在調(diào)控細胞周期阻滯過程中發(fā)揮著十分重要的作用，腫瘤耐藥的產(chǎn)生與p53功能的失調(diào)關(guān)系密切.淫羊藿素(ICT)作為傳統(tǒng)補益中藥，具有抗癌譜廣、逆轉(zhuǎn)化療耐藥、調(diào)節(jié)免疫力等特點.本實驗通過建立細胞周期同步化模型，研究淫羊藿素影響不同p53分型順鉑耐藥卵巢癌細胞株周期阻滯的作用途徑及機制，為復(fù)發(fā)耐藥性卵巢癌治療藥物的研發(fā)提供新思路.

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

三株p53不同分型人卵巢癌細胞株p53野生型C13*、p53變異型A2780cp、p53缺失型SKOV3，由渥太華大學(xué)細胞與分子醫(yī)學(xué)系Tsang Ben教授課題組饋贈[1-2]，儲存于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室.

1.2 主要試劑

淫羊藿素購自廣州杰特偉生物有限公司，胸腺嘧啶核苷酸(TdR)購自Sigma公司，PRMI-1640培養(yǎng)基、質(zhì)量分數(shù)為0.25%胰酶/質(zhì)量分數(shù)為0.02%EDTA、青-鏈霉素、胎牛血清均購自GIBCO公司，二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、吐溫20(Tween-20)均購自Sigma公司，甲醇、無水乙醇均購自廣州化學(xué)制劑廠，苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液、ECL 發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS 上樣緩沖液、anti-GADPH(鼠單克隆抗體)、二抗(抗兔或抗鼠)、一抗二抗去除液(強堿性)均購自碧云天生物技術(shù)公司，anti-CyclinE(兔多克隆抗體)、anti-CyclinB1(鼠單克隆抗體)、Anti-CHK1(鼠單克隆抗體)、Anti-p53(鼠單克隆抗體)均購自Santa Cruz公司.

1.3 主要方法

1.3.1 采用TdR雙阻滯法進行細胞周期同步化

(1)于6孔細胞培養(yǎng)板中接種SKOV3、C13*、A2780cp細胞懸液，以2.5×105/孔接種，培養(yǎng)箱中過夜.

(2)取TdR粉100 mg溶解于10 mL PBS，0.22 μm無菌濾器過濾，完全培養(yǎng)液稀釋成濃度為2.0 mmol/L.待細胞貼壁后，PBS反復(fù)清洗2次，加濃度為2.0 mmol/L TdR完全培養(yǎng)液培養(yǎng)T阻滯.吸出含TdR完全培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)T釋放，后加濃度為2.0 mmol/L TdR完全培養(yǎng)液處理細胞T阻滯小時.

(3)去除TdR后，每隔4 h收集1孔細胞，PBS清洗后消化吹打細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，4 ℃ PBS洗滌吹打，1 000 r/min離心5 min，去上清加200 μL 4 ℃ PBS重懸，再加2 mL -20 ℃體積分數(shù)為75%乙醇反復(fù)吹打，4 ℃過夜，-20 ℃保存.

(4)取固定好的細胞，2 000 r/min離心，去上清，加1 mL PBS混勻，1 000 r/min離心去上清，加入50 mg/mL PI，1 g/L RNase，質(zhì)量分數(shù)為0.1% TritonX-100，避光室溫孵育15 min，40 μm濾網(wǎng)過濾后上機進行流式細胞周期檢測.

1.3.2 淫羊藿素對同步化卵巢癌細胞株周期的阻滯作用

(1)6孔板中接種SKOV3、C13*、A2780cp細胞株，每孔2.5×105個細胞，培養(yǎng)過夜.

(2)進行細胞同步化，待第2次去除TdR后，加入20 μmol/L淫羊藿素進行培養(yǎng)，共分為7個組(表1).

表1 7個不同分組細胞加藥處理Table 1 Seven different groups of cells were treated with different time

(3)收集各組細胞，進行細胞固定及周期檢測.

1.3.3 Western blot檢測CyclinE及CyclinB1蛋白表達水平

(1)將SKOV3、C13*、A2780cp細胞株以2.5×105/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜.

(2)細胞同步化，待第2次去除TdR后，加入濃度為20 μmol/L淫羊藿素進行培養(yǎng)，共分為5個組(表2).

表2 5個不同分組細胞分組加藥處理Table 2 Five different groups of cells were treated with different time

(3)SKOV3、C13*、A2780cp細胞株進行藥物處理后，棄去培養(yǎng)液，4℃PBS洗滌2次，吸盡液體，置于冰上.

(4)每孔加質(zhì)量分數(shù)為1%PMSF的RIPA裂解液100 μL，冰上裂解10 min，細胞刮刮下，繼續(xù)裂解10 min，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清備用.

(5)用BCA蛋白測定試劑盒檢測總蛋白.

(6)用含質(zhì)量分數(shù)為1%PMSF細胞裂解液將所有蛋白配成相同濃度，加入樣本體積量1/4的SDS-PAGE 5× loading buffer，混勻后于100 ℃煮沸5 min備用或-80 ℃保存.

(7)配置SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育及顯色.

1.3.4 Western blot檢測p53及CHK1蛋白表達水平

將SKOV3、C13*、A2780cp細胞收集后以2.5×105/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜.細胞同步化，按照1.3.3步驟進行Western blot檢測，anti-p53、anti-CHK1(稀釋比例為1∶1 000)，分為6組(表3).

表3 6個不同分組細胞加藥處理24 hTable 3 Cells in different groups were treated with drugs for 24 hours

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TdR雙阻滯法細胞周期同步化結(jié)果

(1)對順鉑耐藥性卵巢癌C13*細胞株進行同步化處理，在解除第2次TdR阻滯后各個時段周期分布情況見表4,圖1.TdR去除后0、20及24 h的G1期百分比高于control組及其他各時間段組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TdR去除后4、8 h的S期百分比高于control組及其他各時間段組(P<0.05)；TdR去除后8、12及16 h的G2期百分比高于control組及其他各時間段組(P<0.05).

表4 C13*細胞株同步化后各時段細胞各周期時相百分比

1)與control組相比，P<0.05

(2)順鉑耐藥性卵巢癌A2780cp細胞株同步化處理結(jié)果見表5，圖2.TdR去除后0、16及20 h的G1期百分比高于control組及其他各時間段組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TdR去除后4、8及24 h的S期百分比高于control組及其他各時間段組(P<0.05)；TdR去除后8、12 h的G2期百分比高于control組及其他各時間段組(P<0.05).

表5 A2780cp細胞株同步化后各時段細胞各周期時相百分比

1)與control組相比，P<0.05；

(3)順鉑耐藥性卵巢癌SKOV3細胞株同步化處理結(jié)果見表6,圖3.TdR去除后0、24、28及32 h的G1期百分比高于control組及其他各時間段組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TdR去除后4、8、12及36 h的S期百分比高于control組及其他各時間段組(P<0.05)；TdR去除后12、16及20 h的G2期百分比高于control組及其他各時間段組(P<0.05).

表6 SKOV3細胞同步化后各時段細胞各周期時相百分比

1)與control組相比，P<0.05

2.2 淫羊藿素對同步化順鉑耐藥性卵巢癌細胞株周期阻滯作用

(1)淫羊藿素在最低有效抑制濃度20 μmol/L下對耐藥性卵巢癌C13*細胞株分別作用4、8、16、24、36及48 h各周期時相分布情況見表7,圖4.淫羊藿素作用細胞4 h起G1期百分比即開始升高，并隨作用時間延長而升高，48 h達到峰值，與control組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；S期及G2期百分比隨作用時間延長而降低(P<0.05).

表7 淫羊藿素作用同步化后C13*細胞株各周期時相百分比

(2)淫羊藿素在最低有效抑制濃度20 μmol/L下對耐藥性卵巢癌A2780cp細胞株分別作用4、8、16、24、36及48 h各周期時相分布情況見表8及圖5.淫羊藿素作用細胞4 h起G2期百分比即開始升高，并隨作用時間延長而升高，48 h達到峰值，與control組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G1期百分比隨作用時間延長而降低(P<0.05).

1)與control組相比，P<0.05

表8 淫羊藿素作用同步化A2780cp細胞株各周期時相百分比

(3)淫羊藿素在最低有效抑制濃度20 μmol/L下對耐藥性卵巢癌SKOV3細胞株分別作用4、8、16、24、36及48 h各周期時相分布情況見表9,圖6.淫羊藿素作用細胞4 h起G2期百分比即開始升高，并隨作用時間延長而升高，48 h達到峰值，與control組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G1期百分比隨作用時間延長而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).

2.3 淫羊霍素對順鉑耐藥性卵巢癌細胞株CyclinE及CyclinB1蛋白表達的影響

Western-blot檢測經(jīng)過不同時間淫羊藿素處理后，C13*、A2780cp、SKOV3細胞株的CyclinE及CyclinB1蛋白表達水平變化，采用ImageJ軟件測量各組條帶灰度值，并以目標蛋白與對應(yīng)內(nèi)參蛋白灰度比值進行歸一化校正，結(jié)果如下.

1)與control組相比，P<0.05

表9 淫羊藿素作用同步化SKOV3細胞株各周期時相百分比

1)與control組相比，P<0.05

(1)淫羊藿素作用C13*細胞株能夠顯著降低Cyclin E蛋白的表達水平，4、8、12及24 h與control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，隨作用時間延長下調(diào)效果呈下降趨勢，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Cyclin B1蛋白的表達水平各組間無明顯差異(P>0.05，圖7).

1)與control組相比，P<0.05

(2)淫羊藿素作用A2780cp細胞株能夠顯著降低Cyclin B1蛋白的表達水平，4、8、12及24 h與control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，隨作用時間延長下調(diào)效果呈下降趨勢，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Cyclin E蛋白的表達水平各組間無明顯差異(P>0.05，圖8).

(3)淫羊藿素作用SKOV3細胞株能夠顯著降低Cyclin B1蛋白的表達水平，8、12及24 h與control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨作用時間延長下調(diào)效果呈下降趨勢，而組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Cyclin E蛋白的表達水平各組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,圖9).

2.4 淫羊霍素對順鉑耐藥性卵巢癌細胞株p53及CHK1蛋白表達的影響

Western-blot檢測經(jīng)過24 h濃度為20 μmol/L淫羊藿素處理后，C13*、A2780cp、SKOV3細胞株p53及CHK1蛋白表達水平均變化.淫羊藿素能夠上調(diào)C13*細胞株p53及CHK1蛋白表達，對于A2780cp、SKOV3細胞株僅能上調(diào)CHK1表達，與未經(jīng)淫羊藿素處理組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖10).

1)與control組相比，P<0.05

1)與control組相比，P<0.05

1)與control組相比，P<0.05

3 討論

卵巢癌是致命的婦科惡性腫瘤.手術(shù)和化學(xué)療法是卵巢癌的主要治療方法[3].鉑類化合物是治療卵巢癌的一線化療藥物，但絕大多數(shù)患者治療后會復(fù)發(fā)并對其產(chǎn)生耐藥性[4].

化療耐藥的發(fā)生機制多樣，包括腫瘤藥物運輸率降低、DNA修復(fù)效應(yīng)增強以及機體對DNA損傷耐受等[5].藥物毒性產(chǎn)生的DNA損傷在p53突變或缺失的細胞中不能經(jīng)過p53途徑誘導(dǎo)細胞發(fā)生周期阻滯及凋亡，是化療耐藥產(chǎn)生的最常見原因.突變p53能夠與p63、p73、SP-1等蛋白結(jié)合，促進癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[6].此外，突變型p53也可以激活SREBP，NF-Y，VDR，ETS2或NRF2等蛋白功能，促進活性氧的積累及癌細胞的無限增殖[7-8].突變p53還能誘導(dǎo)細胞進行程序性重排和擴增，分化成具有無限分裂能力的多能干細胞，促進惡性腫瘤形成[9-10].

Stevens等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類的化合物能夠引起多種細胞發(fā)生細胞周期阻滯.Huang等[12]認為淫羊藿素能夠通過上調(diào)pRb、p27Kip1和p16Ink4a，下調(diào)磷酸化的pRb、Cyclin D1、CDK4等蛋白的表達引起胰腺癌PC-3細胞株發(fā)生G1期阻滯以及劑量依賴性的G2/M阻滯.

從同步化后的細胞各周期比例結(jié)果來看，3株細胞的各期峰值均表現(xiàn)為G1期最高，S期較低，G2期最低.分析其原因可能是G1期時長最長，S期較短，G2期最短，收集細胞的間隔時間固定為每4 h一次，因而時間跨度較大的G1期獲取峰值的幾率最高，而較短的S及G2期的收集時間點可能剛好錯過對應(yīng)的峰值出現(xiàn)時間點.另外，同步化處理在細胞進入指數(shù)增長期后方可進行，此時的細胞密度已經(jīng)接近40%～50%，而整個同步化培養(yǎng)時間較長，接近1.5個細胞倍增時長，在同步化處理的后期細胞密度較大，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)可能只夠維持正常細胞的生長，限制了DNA復(fù)制及細胞分裂的進行，因而S期及G2期峰值較低，在實驗過程中，本小組嘗試在同步化過程中給予足量的培養(yǎng)液，在一定程度上提高了S及G2期的峰值水平.此外，不排除部分細胞在TdR阻滯解除后周期運轉(zhuǎn)未能恢復(fù)，仍停滯在G1/S的邊界處，導(dǎo)致G1的峰值增高.

本研究結(jié)果提示，淫羊藿素能夠誘導(dǎo)順鉑耐藥卵巢癌細胞發(fā)生周期阻滯，阻滯類型與p53分型有一定相關(guān)性.其中，p53野生型C13*細胞株發(fā)生G1期阻滯(表7，圖4)，p53變異型A2780cp細胞株(表8，圖5)及p53缺失型SKOV3細胞株(表9，圖6)發(fā)生G2期阻滯，周期阻滯效果具有明顯的時間依賴性.

DNA損傷可通過激活細胞周期G1/S及G2/M兩個檢查點來對周期阻滯進行調(diào)控[13].相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，野生型p53主要對G1/S檢查點發(fā)揮調(diào)控作用，而對G2/M檢查點也能夠發(fā)揮一定的調(diào)控作用[14-15].p53介導(dǎo)的細胞周期阻滯通路下游的調(diào)控蛋白主要包括周期蛋白(Cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(CDKs)、周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI).Cyclin E及Cyclin B1蛋白分別是細胞周期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，分別擔(dān)任著G1/S期及G2/M關(guān)卡檢測點的作用，其表達水平的降低直接會導(dǎo)致細胞難以越過關(guān)卡，發(fā)生周期阻滯現(xiàn)象，進而抑制細胞增殖[16].

為了解淫羊藿素對周期調(diào)控蛋白的影響與p53、周期阻滯及凋亡之間的關(guān)系，本文檢測G1/S及G2/M關(guān)卡調(diào)控蛋白CyclinE、CyclinB1的蛋白表達水平，進一步探討淫羊藿素介導(dǎo)不同p53分型順鉑耐藥卵巢癌細胞發(fā)生周期阻滯所依賴的調(diào)控途徑.Western blot實驗數(shù)據(jù)顯示，淫羊藿素能夠促進p53野生型C13*細胞株p53蛋白激活，并伴隨CyclinE蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，提示淫羊藿素可以通過下調(diào)CyclinE蛋白使得p53野生型順鉑耐藥卵巢癌細胞DNA復(fù)制無法通過G1/S關(guān)卡，發(fā)生G1期的周期阻滯.Du[1]等研究發(fā)現(xiàn)，野生型p53卵巢癌細胞能夠通過p53途徑介導(dǎo)細胞發(fā)生G1期阻滯，而p53缺失型的卵巢癌細胞則還可以通過CHK1途徑介導(dǎo)細胞發(fā)生G2期阻滯.本研究發(fā)現(xiàn)，p53變異型A2780cp及p53缺失型SKOV3細胞株的p53并無明顯激活(P>0.05)，反而出現(xiàn)CHK1蛋白表達增強，并伴隨CyclinB1蛋白下調(diào)現(xiàn)象(P<0.05).由此推測，p53變異及缺失型順鉑耐藥卵巢癌細胞可通過CHK1途徑下調(diào)CyclinB1將細胞阻斷在G2/M關(guān)卡，發(fā)生G2期周期阻滯，與流式細胞技術(shù)的檢測結(jié)果一致.

綜上，淫羊藿素對于不同p53分型的耐藥卵巢癌細胞均能通過不同途徑發(fā)揮周期阻滯作用，融合其作為補益中藥在提高免疫力方面的優(yōu)勢，可以為臨床上復(fù)發(fā)性耐藥卵巢癌的治療提供新思路.