李娜, 苗聰秀, 李丹, 李敏, 付亞靜, 馬甜思

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院 生殖遺傳科， 山西 長治 046000； 長治醫(yī)學(xué)院 生殖遺傳研究所， 山西 長治 046000)

不孕癥是臨床常見疾病，隨著生活節(jié)奏的不斷加快及生活環(huán)境的轉(zhuǎn)變，不孕癥發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，給有生育需求的家庭造成嚴(yán)重傷害[1].近年來輔助生殖技術(shù)迅猛發(fā)展，體外受精-胚胎移植術(shù)(in vitro fertilization embryo transfer，IVF-ET)成為治療不孕癥的重要手段之一，而凍融胚胎移植術(shù)(frozen thawed embryo transfer，F(xiàn)-ET)是將多余優(yōu)質(zhì)胚胎利用凍融技術(shù)，增加患者受孕機(jī)會(huì)的重要手段，目前已廣泛用于臨床[2].F-ET可有效減少胚胎浪費(fèi)、增加受孕機(jī)會(huì)、提高臨床妊娠率，但臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，仍有部分患者多次接受F-ET后妊娠失敗[3].因此，尋找影響F-ET術(shù)后妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素及有效預(yù)測妊娠成功的臨床指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)F-ET術(shù)前干預(yù)、提高妊娠成功率有重要臨床意義.近年來研究顯示，不孕癥患者血清白血病抑制因子(LIF)在分泌中期子宮內(nèi)膜中異常低表達(dá)，多囊卵巢綜合征導(dǎo)致不孕患者血清中肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)異常表達(dá)，推測LIF、HB-EGF是影響受精卵著床、發(fā)育的重要因子[4-5].目前關(guān)于血清LIF、HB-EGF水平對(duì)F-ET術(shù)后妊娠結(jié)局的相關(guān)性及其對(duì)妊娠成功的預(yù)測價(jià)值研究尚少，為此，本研究對(duì)92例擬接受F-ET術(shù)患者的血清LIF、HB-EGF水平進(jìn)行檢測和分析.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月至2019年12月擬進(jìn)行F-ET術(shù)患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≤45歲；②夫妻雙方染色體檢查均無異常；③新鮮胚胎移植術(shù)均未成功妊娠；④女性月經(jīng)周期正常；⑤患者均簽署知情同意書.排除標(biāo)準(zhǔn)：①非F-ET手術(shù)患者；②未進(jìn)行干預(yù)的輸卵管積水患者；③合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者.

選取符合上述標(biāo)準(zhǔn)的92個(gè)周期(92例患者)，女方年齡23～45歲，平均(38.1±4.3)歲；不孕年限1～16年，平均(6.9±1.2)年；體質(zhì)量指數(shù)(21.7±2.7)kg/m2；不孕原因：女方因素47例，男方因素24例，雙方因素11例，不明原因6例；子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：自然周期44例，人工周期48例；體外受精方式：常規(guī)體外受精41例，卵胞漿內(nèi)單精子注射51例.本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

1.2 方法

1.2.1 胚胎凍融及評(píng)估

選取常規(guī)進(jìn)行體外受精-胚胎移植術(shù)后正常受精來源的胚胎，即第3天(D3)胚胎進(jìn)行冷凍.倒置顯微鏡下評(píng)估胚胎質(zhì)量：以卵裂球大小均勻、胞質(zhì)碎片≤10%為Ⅰ級(jí)胚胎；以卵裂球大小比較均勻，胞質(zhì)碎片≤20%為Ⅱ級(jí)胚胎；選?、?、Ⅱ級(jí)優(yōu)質(zhì)胚胎作為冷凍標(biāo)準(zhǔn).采用玻璃化冷凍復(fù)蘇法進(jìn)行.

1.2.2 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植

根據(jù)患者月經(jīng)周期、排卵情況選擇自然周期或人工周期；①自然周期：陰道超聲監(jiān)測優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18 mm、子宮內(nèi)膜厚度達(dá)8 mm，確認(rèn)自然排卵或予以6 000單位人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)排卵，排卵日注射黃體酮20～60 mg/d，連續(xù)注射3d，進(jìn)行胚胎復(fù)蘇，復(fù)蘇2 h后，將2枚優(yōu)質(zhì)胚胎置入子宮，移植后繼續(xù)應(yīng)用黃體酮20～60 mg/d支持.②人工周期：排卵障礙、月經(jīng)周期或子宮內(nèi)膜厚度<8 mm者，常規(guī)應(yīng)用戊酸雌二醇4 mg/d，動(dòng)態(tài)監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度達(dá)8 mm，再給予肌肉注射黃體酮20～60 mg/d，連續(xù)注射4 d，進(jìn)行胚胎復(fù)蘇，復(fù)蘇2 h后，將2枚優(yōu)質(zhì)胚胎置入子宮，移植后繼續(xù)應(yīng)用黃體酮20～60 mg/d支持.

1.2.3 隨訪及分組

移植后第14天檢測血hCG≥50 IU/L則為生化妊娠，第35天B超或陰道超聲檢查提示孕囊及心管搏動(dòng)則為臨床妊娠，納入妊娠組；黃體酮支持至孕12周第35天B超檢查未見孕囊，納入未妊娠組.

1.2.4 血清LIF、HB-EGF水平檢測

移植日采集患者血樣5 mL，室溫靜置平衡30 min，3 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，獲得上層待測血清，采用LIF、HB-EGF ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)，按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定待測樣品光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度.

1.2.5 Logistic回歸分析賦值

收集可能影響妊娠結(jié)局的因素，以BMI、不孕年限、移植日血E2、LH、PLIF、HB-EGF水平為連續(xù)變量，以不孕原因(男方因素=0、女方因素=1、雙方因素=2、不明原因=3)、子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案(自然周期=0、人工周期=1)、移植日子宮內(nèi)膜厚度(>11 mm=0、8～11 mm=1、<8 mm=2)、子宮內(nèi)膜形態(tài)(I型(AB)=0、II(C)型=1)、受精方式(常規(guī)體外受精=0、卵胞漿內(nèi)單精子注射=1)為分類變量，并以上述可能影響因素為自變量，以是否妊娠(妊娠=0、未妊娠=1)為因變量，進(jìn)行Logistic回歸分析.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 妊娠組與未妊娠組可能影響妊娠結(jié)局的因素比較

92個(gè)凍融胚胎移植周期，臨床妊娠32例，臨床妊娠率34.78%；妊娠組與未妊娠組年齡、BMI、不孕年限、E2、LH、P水平、不孕原因、子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、受精方式比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；妊娠組與未妊娠組子宮內(nèi)膜形態(tài)、移植日子宮內(nèi)膜厚度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1).

表1 妊娠組與未妊娠組可能影響妊娠結(jié)局的因素比較Table 1 Comparison of factors that may affect pregnancy outcome between pregnant group and non-pregnant group

2.2 妊娠組與未妊娠組移植日血清LIF、HB-EGF水平比較

妊娠組移植日血清LIF、HB-EGF質(zhì)量濃度高于未妊娠組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2).

表2 妊娠組與未妊娠組移植日血清LIF、HB-EGF水平比較

2.3 Logistic回歸分析導(dǎo)致妊娠失敗的危險(xiǎn)因素

經(jīng)Logistic回歸分析，子宮內(nèi)膜形態(tài)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、血清LIF、HB-EGF水平均是導(dǎo)致F-ET術(shù)后妊娠失敗的危險(xiǎn)因素(OR=3.074、2.563、4.437、3.881，P<0.05,表3).

表3 Logistic回歸分析導(dǎo)致妊娠失敗的危險(xiǎn)因素Table 3 Logistic regression analysis of risk factors leading to pregnancy failure

2.4 血清LIF、HB-EGF水平對(duì)妊娠成功的預(yù)測價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析，血清LIF預(yù)測F-ET術(shù)后妊娠成功的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和AUC分別為84.38%、76.67%、79.35%、0.760，預(yù)測最佳截?cái)帱c(diǎn)為18.40 pg/mL；血清HB-EGF水平預(yù)測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和AUC分別為78.13%、73.33%、75.00%、0.722，預(yù)測最佳截?cái)帱c(diǎn)為31 505.44 pg/mL(表4，圖1).

表4 血清LIF、HB-EGF水平對(duì)妊娠成功的預(yù)測價(jià)值Table 4 Predictive value of serum LIF and HB-EGF levels for pregnancy success

圖1 血清LIF、HB-EGF水平對(duì)妊娠成功預(yù)測的ROC曲線

3 討論

不孕癥原因多種多樣，除女性多囊卵巢綜合征、輸卵管阻塞等因素外，男性因素、遺傳因素等也是不孕癥常見致病因素，另外約有20%患者不孕原因無法確定[6-7].隨著我國輔助生殖技術(shù)不斷發(fā)展，F(xiàn)-ET成為輔助生殖技術(shù)的重要補(bǔ)充技術(shù)，日趨受到重視.臨床研究表明[8-9]，目前F-ET臨床妊娠率仍需提高，其中胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性等多種因素均可影響妊娠結(jié)局，尋找可直接或間接影響子宮內(nèi)膜容受性的因素，對(duì)提高妊娠成功率有重要意義.

本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠組移植日血清LIF、HB-EGF高于未妊娠組；經(jīng)Logistic回歸分析，子宮內(nèi)膜形態(tài)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、血清LIF、HB-EGF水平均是導(dǎo)致F-ET術(shù)后妊娠失敗的危險(xiǎn)因素，提示除子宮內(nèi)膜形態(tài)、移植日子宮內(nèi)膜厚度外，血清LIF、HB-EGF水平也是導(dǎo)致妊娠失敗的危險(xiǎn)因素，兩者與妊娠結(jié)局關(guān)系密切.LIF屬于分泌型糖蛋白，定位于人11號(hào)染色體，具有高度保守型，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)多種細(xì)胞中均可表達(dá)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、誘導(dǎo)肝急性期蛋白等多種生物學(xué)活性[10].研究表明，LIF與子宮內(nèi)膜容受性關(guān)系密切，LIF基因敲除鼠可形成正常受精卵，但無法進(jìn)行著床和發(fā)育[11].Modric等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LIF在豬妊娠早期逐漸增加，在妊娠18 d以后表達(dá)量趨于穩(wěn)定，說明LIF在局部控制滋養(yǎng)層和促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖方面起重要作用.HB-EGF是表皮生長因子家族成員之一，具有較強(qiáng)的促細(xì)胞分裂作用.研究顯示，HB-EGF與其受體結(jié)合后，可通過促進(jìn)黃體成熟、調(diào)節(jié)性激素等途徑，介導(dǎo)胚胎細(xì)胞與子宮內(nèi)膜間的“分子對(duì)話”，為受精卵著床、發(fā)育提供條件[13-14].Fawzy等[15]研究表明，卵胞漿內(nèi)單精子注射后添加LIF、HB-EGF細(xì)胞因子可有效提高胚胎質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局.上述研究與本研究結(jié)果共同說明LIF、HB-EGF可能在提高胚胎質(zhì)量、改善F-ET術(shù)后妊娠結(jié)局方面具有積極意義，而不孕癥患者血清LIF、HB-EGF水平下降，可能通過抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，減小子宮內(nèi)膜容受性，不利于受精卵著床，從而使妊娠失敗.

本研究經(jīng)ROC曲線分析，血清LIF、HB-EGF水平預(yù)測F-ET術(shù)后妊娠成功AUC分別為0.760、0.722，提示兩者對(duì)F-ET術(shù)后妊娠成功有較高預(yù)測價(jià)值.LIF在胚胎著床中起重要作用，研究顯示，LIF存在基因多態(tài)性，且不孕癥人群LIF基因突變導(dǎo)致的在增殖期低表達(dá)，是導(dǎo)致體外受精失敗的原因之一[16].既往研究發(fā)現(xiàn)，HB-EGF可通過自分泌或旁分泌方式促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化，與自身受體結(jié)合后促進(jìn)受精卵著床，或作為生長因子參與胎盤的形成和發(fā)育[17].胚胎發(fā)育早期，HB-EGF通過促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲，提高胚胎存活率，因此，HB-EGF在子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備、胚胎著床及發(fā)育中起重要作用，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證實(shí).

綜上所述，移植日血清LIF、HB-EGF水平與F-ET術(shù)后妊娠結(jié)局關(guān)系密切，且兩者對(duì)F-ET術(shù)后妊娠成功有較高預(yù)測價(jià)值.臨床中在進(jìn)行F-ET術(shù)前應(yīng)加強(qiáng)血清LIF、HB-EGF水平的檢測，便于早期對(duì)臨床妊娠結(jié)局做出預(yù)測，采取及時(shí)有效的干預(yù)手段提高妊娠成功率.