魏巍, 曹繼剛*, 蕭閔, 陳曙輝, 任毅軒

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430065； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 科技中心， 湖北 武漢 430065；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院， 湖北 武漢 430061)

少弱精癥(oligoasthenospermia)是導(dǎo)致男性不育的最常見(jiàn)病因之一，包含少精癥(oligospermia)和弱精癥(asthenozoospermia,AZS)，前者是指精子濃度<15×106/mL,后者是指前向運(yùn)動(dòng)精子率(progressive motility，PR)<32%[1]，其發(fā)病率約占男性不育患者的70%[2].不孕不育困擾了大約20%的育齡夫婦，其中由男性所導(dǎo)致的不育高達(dá)40%～60%，主要問(wèn)題包括精子生成、發(fā)育和運(yùn)輸異常[3].其中約19%與精子活力低下相關(guān)[4].少弱精癥的中醫(yī)藥治療因其不良反應(yīng)少、相對(duì)經(jīng)濟(jì)及患者依從性好受到關(guān)注.中醫(yī)辨證論治具有鮮明的優(yōu)勢(shì)及特色，在臨床中發(fā)現(xiàn)，單一臟腑發(fā)病所致少弱精癥較少，常常是幾個(gè)臟腑兼雜發(fā)病多見(jiàn)，其中又以肝郁腎虛型少弱精癥較為典型[5].目前多以單一造模方式建立少弱精癥動(dòng)物模型[6]，由于單一造模方式不能充分體現(xiàn)少弱精癥的臨床表現(xiàn)，因此探索建立更加符合臨床實(shí)際的多因素少弱精癥動(dòng)物復(fù)合模型無(wú)疑具有重要臨床意義，現(xiàn)已有報(bào)道腺嘌呤可以誘導(dǎo)腎虛型少弱精癥，慢性束縛應(yīng)激刺激可以誘導(dǎo)肝郁，故本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)腺嘌呤灌胃聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激刺激建立肝郁腎虛型少弱精癥的病證結(jié)合的復(fù)合模型.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用6～8周齡的SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量為(180±20)g，購(gòu)于三峽大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012.實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在50%～70%，自由飲水進(jìn)食.適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，選取40只大鼠進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn).

1.1.2 藥物

腺嘌呤：成都普利斯生物科技有限公司，批號(hào)：DST190701-013.阿拉伯樹(shù)膠干粉：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20181212.

1.1.3 試劑及儀器

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)放射免疫試劑盒：武漢基因美生物科技有限公司，貨號(hào)：JYM0335Ra、JYM0574Ra.

普通光學(xué)顯微鏡：Olympus公司；酶標(biāo)儀：普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)為DNM-9602；洗板機(jī)：芬蘭(Thermo Labsystems)，型號(hào)為AC8；離心機(jī)：高速離心機(jī)(himac)，型號(hào)為CR21G；培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國(guó)產(chǎn))，型號(hào)為GNP-9080型；偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)：北京偉力科技公司，型號(hào)為WLJY-9000型；1/10 000電子分析天平：德國(guó)BP61；束縛罐自制；大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)敞箱自制.

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和造模方法

將購(gòu)入后的50只SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選大鼠，以排除有大鼠生理性喜靜從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]，從篩選的大鼠中隨機(jī)選取40只，并隨機(jī)分為空白組，模型組，腎虛組和肝郁組，每組10只.空白組不加任何干預(yù)，正常飼養(yǎng)21 d；模型組予以質(zhì)量濃度為50 mg/mL的腺嘌呤灌胃14 d，并在開(kāi)始灌胃的同時(shí)給予慢性束縛應(yīng)激刺激21 d,每天束縛2次，每次3 h；腎虛組予以質(zhì)量濃度為50 mg/mL的腺嘌呤灌胃14 d后正常飼養(yǎng)7 d；肝郁組予以慢性束縛應(yīng)激刺激21 d,每天束縛2次，每次3 h.造模時(shí)間為21 d.

1.2.2 給藥方法

將阿拉伯膠干粉作為助溶劑與腺嘌呤按照質(zhì)量比1∶1的比例充分混合后，用純凈水將其配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，按照每100 g大鼠體質(zhì)量每天灌胃1 mL進(jìn)行灌胃.

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

(1)一般狀態(tài)觀察

觀察大鼠活動(dòng)、進(jìn)食、排便、體毛光澤度及脫落情況、對(duì)外界刺激敏感等表現(xiàn).

(2)體質(zhì)量測(cè)定

所有大鼠均在建模前，建模后第7天，第14天及第21天稱量體質(zhì)量.

(3)生殖臟器質(zhì)量測(cè)定

分別稱量附睪和睪丸的質(zhì)量.

(4)精子的提取和分析

將附睪放入到1 mL的37 ℃的生理鹽水中,用眼科剪剪碎，放于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育30 min,在1.5 mL的離心管中200目篩過(guò)濾,分離精子與組織殘片然后進(jìn)行精子的密度和活動(dòng)率分析.

(5)cAMP、cGMP質(zhì)量濃度的檢測(cè)

大鼠采用體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，將其四肢及頭部固定于手術(shù)板上,呈仰臥位,將其下腹部毛剔除,碘伏消毒，在大鼠腹腔中找到腹主動(dòng)脈收集血液2～3 mL于抗凝管中，將其編號(hào)，靜置1 h后，放入到離心管中，再放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，4 ℃，15 min留取血清待測(cè).

(6)糖水偏好實(shí)驗(yàn)

第21天造模完成后，給大鼠一瓶蔗糖水、一瓶去離子水及適量的飼料進(jìn)行3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，第4天開(kāi)始禁食、禁水24 h，再進(jìn)行如下的糖水偏好實(shí)驗(yàn)：同時(shí)給予每只動(dòng)物1瓶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖水100 mL和1瓶100 mL的純水，觀察1 h內(nèi)動(dòng)物飲用的蔗糖溶液量，1 h后取走兩個(gè)瓶并用量筒測(cè)量剩余液體體積，計(jì)算糖水偏嗜程度:偏嗜程度=(V糖水消耗/V總液體消耗)×100%.

(7)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

第21天造模結(jié)束后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，過(guò)程如下：整個(gè)實(shí)驗(yàn)是在安靜、四周由全封閉的遮光簾隔離干擾并杜絕參照物的環(huán)境下進(jìn)行，盒子體積為50 cm×50 cm×50 cm,內(nèi)壁及底頂部皆為黑色，將大鼠放入黑色曠場(chǎng)箱中央?yún)^(qū)，曠場(chǎng)箱頂部正中固定一攝像頭，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，觀察5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況.主要指標(biāo)為：總運(yùn)動(dòng)路程，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間，中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)，休息時(shí)間及次數(shù).每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理尿液和糞便，同時(shí)用少量石灰粉清除動(dòng)物留下的氣味后方能開(kāi)始下一只動(dòng)物的實(shí)驗(yàn).

(8)睪丸組織學(xué)觀察

睪丸直接使用體積分?jǐn)?shù)10%的福爾馬林固定24 h后，取出固定組織進(jìn)行修塊，將睪丸組織沿橫軸切開(kāi)后繼續(xù)固定12 h，流水沖洗24 h，再使用去離子水進(jìn)行沖洗.然后進(jìn)行脫水流程：體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇脫水3 h；體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇脫水3 h；體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇脫水過(guò)夜；體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇脫水2 h；體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇Ⅰ脫水2 h；體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇Ⅱ脫水3 h；體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇Ⅰ脫水2 h；體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇Ⅱ脫水2 h.透明流程：二甲苯Ⅰ 30 min；二甲苯Ⅱ 30 min；浸蠟Ⅰ 1 h；浸蠟Ⅱ 1 h.最后將組織采用蠟塊進(jìn)行包埋，并制作成4 μm厚的切片.行HE染色進(jìn)行病理觀察.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合建模對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響

空白組大鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一般狀態(tài)基本一致，精神良好、活動(dòng)度高、對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏、毛色正常、不掉毛、大便麥粒型且干濕適中、生長(zhǎng)正常，飲食正常.肝郁組大鼠在初次束縛時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)烈的反抗，不停掙扎，束縛解除后，迅速逃脫躲藏，活動(dòng)靈敏，容易被激怒，處于急性應(yīng)激期.隨著建模時(shí)間的推移，其反抗與掙扎的表現(xiàn)逐漸減弱，直到建模第3周時(shí)，該組所有大鼠放棄掙扎，解除束縛后弓背扎堆蜷縮在一起，飲食減少，部分大鼠的大便較稀，部分干結(jié).腎虛組大鼠在給予腺嘌呤1周后出現(xiàn)飲食減少，形體逐漸消瘦，第2周開(kāi)始出現(xiàn)明顯的精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、懶動(dòng)喜臥、弓背蜷縮、掉毛、尾巴蒼白、大便稀溏、小便量增多，墊料尚可以2～3 d更換一次，第3周已經(jīng)停止灌胃腺嘌呤后，上述癥狀沒(méi)有緩解，部分大鼠癥狀加重，所有大鼠小便量增多，墊料必須每天更換，大便出現(xiàn)特殊臭味.模型組大鼠初次束縛時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)烈的反抗，不停掙扎，束縛解除后，迅速逃脫躲藏，活動(dòng)靈敏，容易被激怒，處于急性應(yīng)激期，在第1周時(shí)，出現(xiàn)輕度的精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、懶動(dòng)喜臥、弓背蜷縮、掉毛、尾巴蒼白、大便稀溏、小便量增多，在第2周時(shí)，部分大鼠上述癥狀逐漸加重，生長(zhǎng)較前停滯，所有大鼠小便量增多，必需每天更換墊料且大便有特殊臭味.到第3周時(shí)，上述癥狀沒(méi)有緩解，身形瘦弱，束縛時(shí)所有大鼠放棄掙扎.

2.2 復(fù)合建模對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

在建模前至建模第7天，各組間大鼠的體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，至第14天時(shí)，與空白組相比，模型組、肝郁組和腎虛組都出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異變化，且肝郁組與腎虛組體質(zhì)量下降程度最大，第21天模型組、肝郁組和腎虛組較空白組體質(zhì)量差異明顯(P<0.01)，其中模型組較肝郁組及腎虛組體質(zhì)量下降程度更大，并與該兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05).見(jiàn)表1.

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body weight of rats in each group

2.3 復(fù)合建模對(duì)大鼠生殖臟器質(zhì)量的影響

模型組及腎虛組大鼠的睪丸和附睪質(zhì)量較空白組明顯降低(P<0.01)，肝郁組與空白組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).此外，模型組與腎虛組大鼠的睪丸和附睪質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而與肝郁組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見(jiàn)表2.

2.4 復(fù)合建模對(duì)大鼠精子密度和活動(dòng)率的影響

模型組大鼠的精子密度和活動(dòng)率較其他3組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且腎虛組和肝郁組較空白組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見(jiàn)表2.

表2 各組大鼠生殖臟器質(zhì)量、精子密度和活動(dòng)率比較Table 2 Comparison of the quality of reproductive organs, sperm density and motility rate of rats in each group

2.5 復(fù)合建模對(duì)大鼠血清cAMP、cGMP質(zhì)量濃度的影響

建模21 d后，與空白組比較，模型組、肝郁組及腎虛組大鼠血清的ρcAMP及ρcAMP/ρcGMP均明顯降低(P<0.01)，其中模型組降低程度最大，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).與空白組比較，模型組、肝郁組及腎虛組大鼠血清的ρcGMP均明顯升高，其中模型組升高程度最大，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見(jiàn)表3.

2.6 復(fù)合建模對(duì)大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)的影響

建模21 d后，糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組消耗明顯低于其他3組(P<0.01)，其中腎虛組與空白組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).見(jiàn)表4.

2.7 復(fù)合建模對(duì)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響

造模前各組中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和休息時(shí)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造模21 d后，腎虛組與空白組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組及肝郁組與空白組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01).見(jiàn)表4.

表3 各組大鼠cAMP、cGMP質(zhì)量濃度及比值的比較

2.8 復(fù)合建模對(duì)大鼠睪丸組織學(xué)的影響

空白組大鼠睪丸內(nèi)可見(jiàn)結(jié)構(gòu)清晰的呈橢圓形的曲細(xì)精管，形狀規(guī)整,上皮豐滿，管腔內(nèi)有不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞層次分明排列有序，成條索狀，管中央可見(jiàn)精子，為正常睪丸組織結(jié)構(gòu).模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管輪廓塌陷不成橢圓形，萎縮，變形；管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂稀疏，數(shù)量明顯減少；管中央不見(jiàn)精子可見(jiàn)少量脫落上皮細(xì)胞.肝郁組大鼠睪丸曲細(xì)精管生精上皮細(xì)胞排列疏松，生精細(xì)胞脫離基底部向管腔移動(dòng)，曲細(xì)精管壁各層稍紊亂，支持細(xì)胞和生精細(xì)胞呈分離狀，管腔內(nèi)精子減少.腎虛組出現(xiàn)睪丸間質(zhì)不發(fā)達(dá)，生精小管上皮明顯變薄，各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量顯著減少，可見(jiàn)生精細(xì)胞脫落及排列紊亂，支持細(xì)胞嚴(yán)重變性，管腔內(nèi)精子明顯減少.見(jiàn)圖1.

圖1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×100)

3 討論

理想的病證結(jié)合動(dòng)物模型是現(xiàn)代中醫(yī)藥科研非常重要的工具.

3.1 模型建立依據(jù)

“腎為先天之本”“腎主生殖”，從腎論治男性生殖疾病成為共識(shí)[8].實(shí)驗(yàn)采用藥物導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎虛的病理模型是目前制備腎虛型不育癥的主要方法之一[9].而腺嘌呤(adenine)因被證實(shí)有生殖功能損傷作用，而用于不育癥的建模，有研究認(rèn)為其生殖功能損傷的機(jī)理可能是腺嘌呤通過(guò)黃嘌呤氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基損害性腺，致生精功能減退[10-11],同時(shí)可通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)影響睪丸血液循環(huán)來(lái)?yè)p害性腺，使睪酮合成減少[12].腺嘌呤不僅造成生殖損傷，亦能造成中醫(yī)腎虛證候[10]，研究表明腺嘌呤經(jīng)消化道吸收，在黃嘌呤氧化酶作用下，形成極難溶于水的2，8-二羥基腺嘌呤并大量沉積于腎臟形成結(jié)晶，阻塞并壓迫腎小管，引起腎小管上皮損傷和腎間質(zhì)肉芽腫性炎癥，晚期出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化，造成腎功能損害[13]，最終形成腎衰竭，其產(chǎn)物毒性抑制腎臟中多種代謝酶的活性，影響腎臟的能量代謝，故腺嘌呤誘導(dǎo)的腎虛模型大鼠尿量明顯較多，與此同時(shí)還抑制HPG軸，進(jìn)而出現(xiàn)食欲下降、飲水量增多、畏寒、體毛稀疏、失去光澤等符合中醫(yī)學(xué)腎虛的癥狀[14-15].已有文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建腎虛型少弱精癥模型使用腺嘌呤的質(zhì)量濃度為50 mg/mL,每100 g大鼠體質(zhì)量每天灌胃1 mL[16]，給藥第9天就已經(jīng)出現(xiàn)中醫(yī)腎虛癥狀并逐漸形成腎損傷，第12天以后損傷不可逆，且停藥后仍會(huì)進(jìn)行性加重[16].

有研究表明情志的不遂，會(huì)引起肝氣郁結(jié)，可以導(dǎo)致少弱精癥[17].肝主疏泄，喜條達(dá)，又肝腎同源，與男性生殖系統(tǒng)主要疾病關(guān)系密切.有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝郁證與男女性腺生殖系統(tǒng)疾病相關(guān)，并且在臨床中發(fā)現(xiàn)肝郁證患者的血清性激素水平與正常人有所差異[18]，故心理應(yīng)激可以影響肝的疏泄功能，從而在一定程度上影響HPG軸引起內(nèi)分泌紊亂而誘發(fā)少弱精癥.目前肝郁證的造模方法眾多，而慢性束縛應(yīng)激刺激(chronic restraint stress,CRS)對(duì)機(jī)體無(wú)損傷性刺激，并與人類身心疾病的發(fā)展過(guò)程類似，故是目前制備心理應(yīng)激動(dòng)物模型的經(jīng)典方法之一[19]，建模時(shí)間約為7～21 d，每次束縛時(shí)間為3～4 h，每天1～2次[19-22].慢性束縛作為一種非損傷性應(yīng)激刺激，不能完全破壞機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)，所以在撤掉應(yīng)激刺激后需要考慮模型恢復(fù)問(wèn)題，查閱利用該方法進(jìn)行造模的文獻(xiàn)，普遍報(bào)道其模型效應(yīng)基本都能持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束[23].

據(jù)此將兩者進(jìn)行適當(dāng)?shù)寞B加從而建立肝郁腎虛型少弱精癥大鼠模型具有一定的可行性.

3.2 模型的評(píng)價(jià)

3.2.1 一般狀態(tài)分析

空白組大鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一般狀態(tài)基本一致，生長(zhǎng)良好.肝郁組大鼠在初次束縛后因?yàn)樘幱诩毙詰?yīng)激期，急劇強(qiáng)烈的外在刺激導(dǎo)致本組大鼠行為異常，躁動(dòng)不安，具體表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反抗，不停掙扎，束縛解除后，迅速逃脫躲藏，活動(dòng)靈敏，容易被激怒.從初次接受應(yīng)激源刺激，到建模第3周時(shí)，肝郁組大鼠已經(jīng)從急性應(yīng)激狀態(tài)變成慢性應(yīng)激狀態(tài)，為了適應(yīng)此刺激，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，會(huì)出現(xiàn)一系列病理變化，一般狀態(tài)表現(xiàn)為該組所有大鼠放棄掙扎，飲食減少，解除束縛后弓背扎堆蜷縮在一起，部分大鼠會(huì)出現(xiàn)大便較稀，部分干結(jié)的情況.這說(shuō)明CRS法通過(guò)其慢性、低強(qiáng)度、長(zhǎng)期的應(yīng)激源可以使實(shí)驗(yàn)大鼠達(dá)到肝郁狀態(tài)，是制備肝郁模型的主要造模方法之一[19].該方法受中醫(yī)界的認(rèn)可，主要是該方法對(duì)機(jī)體無(wú)損傷性刺激，并且與人類身心疾病的發(fā)展較為類似[19].故從一般狀態(tài)表現(xiàn)來(lái)看，肝郁模型復(fù)制是成功的.腎虛組大鼠在給予腺嘌呤灌胃造模一周后，可能已經(jīng)形成2，8-二羥基腺嘌呤造成腎損傷，故初步表現(xiàn)出腎虛的癥狀，即飲食減少，形體消瘦；到建模第2周時(shí)，已經(jīng)出現(xiàn)明顯的腎損傷，腎虛趨勢(shì)基本形成，并且逐漸加重，具體表現(xiàn)為精神萎靡明顯、反應(yīng)遲鈍、懶動(dòng)喜臥、弓背蜷縮、掉毛、尾巴蒼白、大便稀溏、小便量明顯增多；至建模第3周時(shí)，雖然已經(jīng)停止腺嘌呤灌胃，但是因?yàn)橐呀?jīng)造成不可逆的腎損傷，且腎損傷持續(xù)加重，故上述癥狀不僅沒(méi)有緩解，部分大鼠甚至出現(xiàn)癥狀加重的情況，因腎開(kāi)竅于前后二陰，故所有大鼠小便量增多，墊料必須每天更換，大便出現(xiàn)特殊臭味，這亦可能提示腎衰的形成.故腎虛組出現(xiàn)的癥狀基本符合中醫(yī)腎虛的證候[24]，說(shuō)明腎虛的模型復(fù)制較為成功.模型組大鼠初次束縛后處于急性應(yīng)激期，具體表現(xiàn)與肝郁組初次束縛后表現(xiàn)一致，但因?yàn)橥瑫r(shí)需要灌胃腺嘌呤，腺嘌呤導(dǎo)致的腎損傷急劇破壞了大鼠機(jī)體穩(wěn)態(tài)，縮短了大鼠急性應(yīng)激狀態(tài)的時(shí)間，加快了大鼠進(jìn)入慢性應(yīng)激狀態(tài)的進(jìn)程，故在建模第1周時(shí)，大鼠便出現(xiàn)了弓背蜷縮、輕度的精神萎靡、大便稀溏、掙扎狀態(tài)不如肝郁組激烈的表現(xiàn)，并且因腎虛癥狀的出現(xiàn)而表現(xiàn)為掉毛、尾巴蒼白、反應(yīng)遲鈍、懶動(dòng)喜臥、小便量增多等；肝腎同源，二者生理病理可以相互影響，故在建模第2周時(shí)，因腎損傷持續(xù)加重，模型組大鼠較肝郁組提前進(jìn)入慢性應(yīng)激狀態(tài)，兩種刺激的相互作用使部分大鼠的上述癥狀逐漸加重，出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，甚至生長(zhǎng)停滯，所有大鼠小便量增多，必須每天更換墊料且大便有特殊臭味.到建模第3周時(shí)，腎損傷已經(jīng)不可逆，且持續(xù)加重，加之大鼠全部處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，故上述癥狀沒(méi)有緩解，身形瘦弱，束縛時(shí)所有大鼠放棄掙扎，建模完成后模型組大鼠具有肝郁組及腎虛組的所有癥狀表現(xiàn)，從中醫(yī)證候角度看，符合肝郁腎虛的證型.

3.2.2 體質(zhì)量及生殖臟器質(zhì)量分析

正常情況下，機(jī)體功能正常，肝氣條達(dá)，通暢氣機(jī)，脾胃升降功能正常；腎為先天之本，腎陽(yáng)充足，則能溫煦脾陽(yáng)，則脾胃運(yùn)化功能正常.脾胃為后天之本，氣血生化之源，肝腎功能正常，則脾胃能源源不斷產(chǎn)出氣血，機(jī)體才能正常生長(zhǎng)發(fā)育，體現(xiàn)在體質(zhì)量及生殖臟器質(zhì)量上.

空白組生長(zhǎng)正常，體質(zhì)量及生殖臟器質(zhì)量正常.肝郁組出現(xiàn)體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，且與空白組有明顯差異，說(shuō)明本組大鼠的肝郁影響了脾胃功能，導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩，但未導(dǎo)致生殖臟器質(zhì)量的下降，考慮單一應(yīng)激刺激在該造模時(shí)間內(nèi)無(wú)法造成明顯器質(zhì)性病變.腎虛組出現(xiàn)體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，且與空白組有明顯差異，說(shuō)明本組大鼠的腎虛影響了脾胃功能，導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩，且生殖臟器質(zhì)量較空白組減輕，差異明顯，表示生殖臟器發(fā)育不良，可能會(huì)影響內(nèi)分泌，從而影響生殖機(jī)能，出現(xiàn)少弱精癥[16].模型組出現(xiàn)體質(zhì)量下降，與空白組、肝郁組比較均差異明顯，而與腎虛組沒(méi)有明顯差別，生殖臟器與空白組和肝郁組有明顯差異，與腎虛組沒(méi)有明顯差別，同樣表示生殖臟器發(fā)育不良，可能會(huì)影響到生殖機(jī)能，出現(xiàn)少弱精癥，并且體質(zhì)量及生殖臟器質(zhì)量的下降主要原因可能是腺嘌呤造成的腎虛所致.

3.2.3 行為學(xué)分析

糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠反應(yīng)快感消失的有效指標(biāo)，是目前最為可靠的行為學(xué)觀察及檢測(cè)指標(biāo).曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是利用新環(huán)境的恐懼心理和探索心態(tài)來(lái)評(píng)估大鼠是否出現(xiàn)抑郁癥患者興趣低下，活動(dòng)減少等表現(xiàn)，它是檢測(cè)大鼠抑郁癥行為學(xué)的重點(diǎn)指標(biāo).本研究中，肝郁組出現(xiàn)體質(zhì)量緩慢增長(zhǎng)，糖水偏好降低，及中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)下降，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間及休息時(shí)間上升，表現(xiàn)出興趣和快感下降等抑郁狀態(tài)[25]，表明肝郁模型的復(fù)制是成功的.腎虛組與空白組比較，糖水偏好有明顯差異，而曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有差異，該結(jié)果只能表明大鼠的反應(yīng)快感消失，而在興趣活動(dòng)上正常，這種結(jié)果可能是腺嘌呤造成腎陽(yáng)虛所導(dǎo)致的，所以腎虛組沒(méi)有肝郁.模型組表現(xiàn)出糖水偏好降低，及中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)下降，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間及休息時(shí)間上升，與空白組相比有明顯差異，說(shuō)明模型組中肝郁模型的復(fù)制是成功的.

3.2.4 血清學(xué)指標(biāo)分析

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)與鳥(niǎo)嘌呤核糖苷(cGMP)是目前最常用的反映腎中陰陽(yáng)虧虛的客觀指標(biāo)，其中以cAMP質(zhì)量濃度降低，cGMP質(zhì)量濃度升高，其比值降低判斷為腎陽(yáng)虛[9].本研究中肝郁組中cAMP質(zhì)量濃度降低，cGMP質(zhì)量濃度升高，其比值降低，與空白組相比較有明顯差異，但cAMP質(zhì)量濃度的降低亦可見(jiàn)于抑郁癥[18]，基于中醫(yī)“肝腎同源”理論，肝腎之間可以互相影響，所以該數(shù)據(jù)不能完全說(shuō)明肝郁組有無(wú)腎虛癥狀.腎虛組中cAMP質(zhì)量濃度降低，cGMP質(zhì)量濃度升高，其比值降低，與空白組相比較有明顯差異，可以表明腎虛模型復(fù)制是成功的.模型組中cAMP質(zhì)量濃度降低，cGMP質(zhì)量濃度升高，其比值降低，與空白組比較有明顯差異，可以表明模型組中腎虛模型的復(fù)制是成功的，且與肝郁組和腎虛組相比較差距亦很明顯，可以從側(cè)面反應(yīng)中醫(yī)“肝腎同源”理論.

3.2.5 精子密度和活動(dòng)率分析

精子常規(guī)檢測(cè)是目前檢測(cè)男性生育功能最直接的方法，其中精子密度和活動(dòng)率是最直觀、最基本的生殖功能檢測(cè)，能夠反映男性精子的數(shù)量及活力.本研究中，肝郁組的精子密度和活動(dòng)率較空白組有明顯差異，說(shuō)明CRS模型所致的肝郁可以導(dǎo)致少弱精癥.腎虛組的精子密度和活動(dòng)率較空白組有明顯差異，說(shuō)明腺嘌呤誘導(dǎo)的腎虛可以導(dǎo)致少弱精癥.模型組的精子密度、活動(dòng)率與空白組相比均顯著降低.與肝郁組和腎虛組相比較，亦有明顯差異，可以初步表明兩種方法的疊加，比其中任何一個(gè)單一建模法的效果要好.

3.2.6 睪丸組織學(xué)分析

睪丸是男性主要生殖器官，主要由曲細(xì)精管和睪丸間質(zhì)組成.本研究觀察到模型組曲細(xì)精管輪廓塌陷不成橢圓形，萎縮，變形；管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂稀疏，數(shù)量明顯減少；管中央不見(jiàn)精子.表明從組織形態(tài)學(xué)上其生殖機(jī)能受到明顯損傷.

3.3 不足與展望

雖然模型的建立與評(píng)價(jià)都具有可行性，較為符合病證結(jié)合的要求，但是根據(jù)解剖實(shí)驗(yàn)大鼠時(shí)觀察到此造模方法的腎毒性以及對(duì)生殖臟器的損傷，本研究認(rèn)為對(duì)臟器的不可逆損傷可能會(huì)影響到藥物的治療效果以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差，并且臨床中絕大多數(shù)少弱精癥患者的腎功能是正常的，故仍需探尋更加合理的造模劑；其次，用于評(píng)價(jià)腎虛的血清指標(biāo)中，有和肝郁相雷同的部分，造成肝郁組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能明確說(shuō)明是否有腎虛，故考慮后期納入更加專一性的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)；再次，生殖臟器質(zhì)量變化、病理切片和精液分析只能得出有生殖損傷，但是具體機(jī)理并不能解釋，臨床中，多數(shù)患者的血清性激素有異常，故考慮將血清性激素納入評(píng)價(jià)指標(biāo)，使其更加貼近臨床.

故此模型可行，可以為少弱精癥的中醫(yī)藥研究提供一種思路，但并非最優(yōu)，有待進(jìn)一步深入探討及改善.