劉詩俐, 王哲彥, 李珍, 王萍, 董文其

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州 5100802; 2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 分子影像中心, 廣東 珠海 519000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是引起許多慢性肝病的主要原因，全球的患病率約為24%，早期主要表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，HAFL)[1].由于氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙等原因，NAFL將逐漸發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化，乃至發(fā)展為肝癌[2-3].細(xì)胞珠蛋白(cytoglobin，CYGB)是由日本學(xué)者Kawada在2001年研究大鼠肝星狀細(xì)胞激活的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新型球蛋白，最早被命名為肝星狀激活蛋白(stellate cell activation-associated protein，STAP)[4].CYGB是人體內(nèi)廣泛表達(dá)的一種六配位蛋白，作為球蛋白家族的一員，CYGB具有一氧化氮雙加氧酶活性，參與細(xì)胞內(nèi)氧的儲存和運(yùn)輸[5].既往研究表明，CYGB通過清除肝星狀細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧及羥基自由基，保護(hù)DNA免遭損傷[6]，具有抑制肝星狀細(xì)胞激活與遷移的作用[7-9]，而CYGB的缺乏會導(dǎo)致膽管結(jié)扎小鼠早期肝細(xì)胞損傷和炎癥增強(qiáng)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[10].目前，已有大量證據(jù)表明CYGB會抑制NAFLD過程的發(fā)展，但CYGB對NAFLD早期肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響及分子機(jī)制的研究較少，因此，本研究通過構(gòu)建人肝細(xì)胞系LO-2細(xì)胞脂肪變性模型，探究CYGB對NAFLD早期脂質(zhì)沉積的影響，初步發(fā)現(xiàn)LO-2細(xì)胞脂肪變性的過程中伴隨炎癥增強(qiáng)，而CYGB可能參與抑制LO-2細(xì)胞脂質(zhì)生成和炎性因子表達(dá)的過程，通過抑制NF-κB信號通路，下調(diào)甘油三酯及總膽固醇水平，緩解脂質(zhì)沉積.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

人正常肝細(xì)胞LO-2由南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院生物治療研究所李紅衛(wèi)教授饋贈，本實(shí)驗(yàn)室保存；人肝細(xì)胞株LO-2-GFP-CYGB及陰性對照組細(xì)胞株LO-2-GFP由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建[11].

1.1.2 試劑與儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)購自GIBICO；L-谷氨酰胺，棕櫚酸及油紅O購自SIGMA；油酸購自上海麥克林生化科技有限公司；無脂肪酸牛血清白蛋白購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；甘油三酯(TG)及總膽固醇(T-CHO)測試盒購自南京建成海浩生物科技有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自廣州維德昕生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；2× SYBR Green qPCR Master Mix購自美國Bimake公司； Western裂解液、PMSF、PDTC、一抗稀釋液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛及蘇木素染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)兔多抗、白介素6(interleukin-6,IL-6)鼠單抗、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)兔多抗、山羊抗兔及山羊抗鼠IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；β-actin鼠單抗(8F10)購自成都正能生物有限責(zé)任公司；NF-κB P65兔單抗購自美國Cell Signaling Technology公司；NF-κB PP65兔單抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自Millipore公司.

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific；倒置顯微鏡、垂直電泳槽及濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀購自BIO-RAD；化學(xué)發(fā)光儀購自GE；酶標(biāo)儀購自BIO-TEK.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LO-2細(xì)胞分離和培養(yǎng)

人肝細(xì)胞株LO-2用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到80%～90%時(shí)，使用含EDTA的胰酶消化3 min，以1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)或凍存.

1.2.2 LO-2細(xì)胞脂肪變性模型構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]的方法構(gòu)建LO-2細(xì)胞脂肪變性模型.取19.04 μL油酸與3 mL濃度0.1 mol/L的NaOH溶液混合，置于75 ℃水浴鍋皂化20 min，稱取0.6 g無脂肪酸牛血清白蛋白溶解于3 mL PBS中,兩者混合靜止30 min后4 ℃保存，即配得濃度10 mmol/L的油酸儲存液；稱取0.030 72 g棕櫚酸與3 mL濃度0.1 mol/L的NaOH溶液混合，置于75 ℃水浴鍋皂化20 min，稱取1.2 g無脂肪酸牛血清白蛋白完全溶解于3 mL PBS中,兩者混合靜止30 min后4 ℃保存，即配得濃度20 mmol/L的棕櫚酸儲存液.使用時(shí)棕櫚酸儲存液以體積比1∶200，油酸儲存液以體積比1∶50加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后即為LO-2細(xì)胞脂肪變性模型.

1.2.3 油紅O染色鑒定LO-2脂質(zhì)沉積情況

③??????? ?［加］威 廉 ·萊斯:《滿足的限度 》，李永學(xué)譯，商務(wù)印書館 2016 年版，第 13 ～26、42、145、37、2、115、8、135、6 頁。

以異丙醇溶解并配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的油紅O母液，使用時(shí)以油紅O母液與去離子水按3∶2混勻即可.制作LO-2細(xì)胞爬片后高脂培養(yǎng)24 h，無菌PBS清洗干凈后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，無菌PBS清洗干凈后用體積分?jǐn)?shù)為60%異丙醇浸洗15 s后，油紅O染色10 min，體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇分化10 s，去離子水洗凈后蘇木素染色液染色2 min，洗凈甘油封片，倒置顯微鏡鏡下觀察拍照.

1.2.4 qRT-PCR檢測脂質(zhì)生成相關(guān)基因

使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒說明書配置溶液，42 ℃ 10 min、37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用2× SYBR Green qPCR Master Mix配置成10 μL體系后進(jìn)行QPCR，程序設(shè)定為95 ℃ 10 min，以95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，經(jīng)歷1個(gè)溶解曲線循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)即可.使用的引物委托北京擎科生物公司合成，序列見表1.

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 細(xì)胞甘油三酯、總膽固醇水平測定

LO-2細(xì)胞高脂培養(yǎng)48 h后，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%的Triton裂解液冰上裂解30 min，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測試盒的說明要求配置空白組、標(biāo)準(zhǔn)組及樣本組，每組設(shè)立3個(gè)重復(fù)對照，混勻，37 ℃孵育10 min，波長510 nm，酶標(biāo)儀測定各組吸光度值(D).根據(jù)公式計(jì)算甘油三酯或總膽固醇水平(mmol/g)：

1.2.6 Western blot 檢測NK-κB p65、PP65、IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平

LO-2細(xì)胞高脂分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h收集，用含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑裂解液冰上裂解30 min后提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，使用抗β-actin抗體與抗體稀釋液以1∶5 000稀釋，NF-κB p65、NF-κB PP65、IL-1β、IL-6及TNF-α抗體分別與抗體稀釋液以1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再分別使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗鼠或山羊抗兔抗體孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min.ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，化學(xué)發(fā)光儀成像拍照.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析.以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 CYGB在過表達(dá)組與對照組中的表達(dá)水平

1)與NC組比較，P<0.051) Compared with the NC group, P<0.05

2.2 CYGB對脂變LO-2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

LO-2細(xì)胞高脂培養(yǎng)24 h時(shí)，脂質(zhì)沉積情況通過油紅O染色顯示(圖2A).qRT-PCR結(jié)果顯示，CYGB組中與脂質(zhì)生成相關(guān)的基因ACACA、ACACB、FASN、ACSS1、ACSS2、ACSS3 mRNA相對表達(dá)量均低于NC組(P<0.05,圖2B).CYGB組中甘油三酯及總膽固醇水平在高脂培養(yǎng)48 h時(shí)均低于NC組(P<0.05,圖2C、D)，以上結(jié)果說明CYGB在LO-2中過表達(dá)時(shí)下調(diào)細(xì)胞脂質(zhì)水平，緩解細(xì)胞脂質(zhì)沉積.

2.3 CYGB對LO-2細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)的影響

CYGB組與對照組經(jīng)高脂培養(yǎng)6、12、24 h，Western blot測得Il-1β及IL-6的表達(dá)情況(圖3A)及高脂培養(yǎng)0、12、24、48 h時(shí)測得TNF-α的表達(dá)情況(圖3B)，結(jié)果顯示，過多的游離脂肪酸促進(jìn)LO-2細(xì)胞IL-1β和TNF-α表達(dá)(P<0.05)，CYGB抑制LO-2細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)(P<0.05)，說明L0-2細(xì)胞在脂肪變性過程中伴隨炎性因子釋放增強(qiáng)， 而CYGB在LO-2細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)可能具有抑制炎癥的作用.

1)與NC組比較，P<0.05. A: CYGB組與NC組高脂培養(yǎng)24 h后油紅O染色情況(400×).B:CYGB組與NC組高脂培養(yǎng)24 h后ACACA、ACACB、FASN、ACSS1、ACSS2、ACSS3 mRNA 表達(dá)情況.C: CYGB組與NC組高脂培養(yǎng)48 h后細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平.D: CYGB組與NC組高脂培養(yǎng)48 h后細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平.

1)與NC組比較，P<0.05;2)與0 h比較，P<0.05. A:LO-2細(xì)胞在高脂刺激后IL-1β，IL-6的表達(dá)水平.B: LO-2細(xì)胞在高脂刺激后TNF-α的表達(dá)水平.

2.4 NF-κB通路對LO-2細(xì)胞甘油三酯、總膽固醇水平的影響

用含有不同濃度(0、60、90 μmol/L)的NF-κB抑制劑PDTC和高脂成分的培養(yǎng)液處理LO-2細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，90 μmol/L PDTC可下調(diào)LO-2甘油三酯和總膽固醇水平(P<0.05,圖4A、B).

2.5 CYGB對NF-κB通路的影響

高脂刺激24 h后，NF-κB通路激活，P65和P-P65表達(dá)增加，而CYGB組與NC組相比，NF-κB P65表達(dá)水平在24 h開始下調(diào)(P<0.05)，P-P65 在48 h時(shí)下調(diào)(P<0.05,圖5)，表明過多的脂肪酸攝取激活LO-2細(xì)胞 NF-κB信號通路，而CYGB的過表達(dá)表現(xiàn)出抑制NF-κB通路的現(xiàn)象.

1)與高脂處理48 h相比，P<0.05. A:60、90 μmol/L濃度的PDTC對脂變LO-2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平的影響.B: 60、90 μmol/L濃度的PDTC對脂變LO-2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇水平的影響.

1)與NC組比較，P<0.05. 高脂培養(yǎng)后，LO-2細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65，P-P65表達(dá)水平.

3 討論

NAFLD的早期主要表現(xiàn)為肝臟單純性脂肪變性，而肝細(xì)胞損傷并伴隨炎癥增強(qiáng)，將逐漸發(fā)展為NASH，不僅增加了系統(tǒng)性血管內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，還可能發(fā)展為肝硬化甚至是肝癌[14-15].盡管有諸多研究報(bào)道了NAFLD的發(fā)病機(jī)制和治療策略，但NAFLD其中的分子機(jī)制與靶向治療仍需進(jìn)一步的研究.CYGB作為球蛋白家族的新成員，CYGB被認(rèn)為具有一氧化氮雙加氧酶活性，通過調(diào)控體內(nèi)NO水平調(diào)節(jié)O2，參與抗氧化和低氧調(diào)節(jié)，具有抑制腫瘤的作用[5-6, 16-17].本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYGB能顯著改善大鼠肝纖維化，對大鼠酒精性脂肪肝、高血脂及動脈粥樣硬化均具有一定的治療作用[18-20].但是CYGB的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制還未完全清楚，因此，本研究構(gòu)建了CYGB穩(wěn)定過表達(dá)的人正常肝細(xì)胞株LO-2[11]，來進(jìn)一步探究CYGB對肝細(xì)胞功能和代謝的影響.

研究表明，CYGB通過清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS及抗氧化應(yīng)激等過程來抑制NAFLD的發(fā)展[6, 21].然而，關(guān)于CYGB對NAFLD早期肝細(xì)胞單純性脂肪變性過程的影響與機(jī)制研究較少，因此，本研究通過高脂培養(yǎng)液培養(yǎng)LO-2細(xì)胞，來模擬NAFLD早期肝細(xì)胞脂肪變性的過程，探究CYGB對LO-2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響及分子機(jī)制.本研究發(fā)現(xiàn)，LO-2細(xì)胞通過不斷攝取游離脂肪酸，促進(jìn)脂質(zhì)沉積過程，而在CYGB過表達(dá)組中，與脂質(zhì)生成相關(guān)基因ACACA、ACACB、FASN、ACSS1、ACSS2、ACSS3的表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯及總膽固醇水平低于對照組，提示 CYGB緩解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的原因可能是通過抑制細(xì)胞脂質(zhì)合成過程完成的.

既往研究表明，在膽汁淤積性肝病中，CYGB敲除后的小鼠與野生型小鼠相比，肝臟中NO代謝物和氧化應(yīng)激水平增加，進(jìn)一步增強(qiáng)早期炎癥和肝細(xì)胞損傷[10]；在NASH小鼠模型中，CYGB敲除小鼠出現(xiàn)了明顯的炎癥和纖維化，最終發(fā)展成肝癌[22].在本研究中，過多的脂肪酸攝取會促進(jìn)LO-2細(xì)胞IL-1β、TNF-α的釋放，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，而CYGB過表達(dá)組中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均低于對照組，提示在LO-2細(xì)胞脂肪變性過程中伴隨炎癥的發(fā)生，而CYGB可能通過抑制炎癥而幫助減緩LO-2細(xì)胞脂肪變性.

核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)家族參與免疫反應(yīng)、炎癥和癌癥的調(diào)節(jié)[23].有研究表明，NF-κB參與并促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪酸攝取過程[24]，參與肝纖維化的形成，促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)沉積，抑制NF-κB信號通路，明顯改善了小鼠肝纖維化[25].有臨床研究發(fā)現(xiàn)，在臨床肝癌患者的組織樣本中，NF-κB表達(dá)水平明顯上調(diào)[26]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，在LO-2細(xì)胞脂肪變性過程中，NF-κB信號通路激活，而通過抑制NF-κB通路，LO-2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇水平降低，緩解脂質(zhì)沉積.結(jié)合以上研究，提示在NAFLD早期肝細(xì)胞脂肪變性過程中，大量游離脂肪酸激活NF-κB通路，而NF-κB通路的激活可能會進(jìn)一步誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積.另外，本研究發(fā)現(xiàn)，CYGB過表達(dá)組在高脂處理24 h后出現(xiàn)抑制NF-κB信號通路的現(xiàn)象，通過抑制NF-κB通路，脂質(zhì)沉積得到緩解，說明CYGB可能通過抑制NF-κB通路來緩解LO-2細(xì)胞脂質(zhì)沉積.此外，由于本研究是基于CYGB穩(wěn)定過表達(dá)的LO-2細(xì)胞株進(jìn)行研究的，與人正常肝細(xì)胞株LO-2的基因表達(dá)與代謝功能可能會有所差異，因此，關(guān)于CYGB對NAFLD早期脂質(zhì)代謝的影響需要更多的探索與深入研究.

綜上所述，本研究通過構(gòu)建人正常肝細(xì)胞LO-2脂肪變性模型，探究CYGB對NAFLD早期脂質(zhì)沉積的影響及分子機(jī)制，初步發(fā)現(xiàn)過多的游離脂肪酸攝取誘導(dǎo)LO-2細(xì)胞脂質(zhì)沉積，誘導(dǎo)NF-κB信號通路激活，伴隨炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，而CYGB可能抑制炎性因子表達(dá)，通過抑制NF-κB信號通路，下調(diào)甘油三酯及總膽固醇水平，緩解LO-2脂質(zhì)沉積.本研究初步發(fā)現(xiàn)CYGB緩解LO-2脂質(zhì)沉積的分子機(jī)制并為NAFLD早期治療提供了理論依據(jù).