賈兵,余桃,郭國(guó)凌,王友煜,許波,劉普,衡偉,朱立武

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,安徽 合肥 230036)

中國(guó)是世界上梨(Pyrusspp.)栽培面積最大的國(guó)家,2017年,梨栽培面積約96萬(wàn)hm2,總產(chǎn)量約1 653萬(wàn)t,分別占世界總面積和總產(chǎn)量的69.1%和68.4%[1]?！X山酥梨’果實(shí)有宿萼果與脫萼果之分,宿萼果果實(shí)大,但果形不端正,風(fēng)味比脫萼果差,外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如PBO、PP333、Flusilazole可調(diào)控果實(shí)萼片的脫落,提高脫萼果率,在生產(chǎn)上得到了應(yīng)用[2]。

梨屬植物可劃分成宿萼組和脫萼組,其中西洋梨屬宿萼組,因此,未見(jiàn)有歐美學(xué)者開(kāi)展梨果萼片脫落與宿存等方面的研究。白梨、新疆梨中的‘碭山酥梨’‘庫(kù)爾勒香梨’等品種屬脫萼組[3]。國(guó)內(nèi)主要圍繞植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、授粉、光照等對(duì)梨萼片發(fā)育的影響,脫萼果與宿萼果中內(nèi)源激素含量的比較等方面開(kāi)展了相關(guān)研究。

梨果實(shí)萼片宿存與脫落過(guò)程基因表達(dá)譜分析表明,萼片宿存與脫落涉及激素合成、應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)基因的表達(dá)[4]。IAA通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(auxin influx transporter,AUX)進(jìn)入膜內(nèi),與受體蛋白1(transport inhibitor response protein 1,TIR1)結(jié)合,并與CUL1(cullin 1)蛋白相互作用,形成泛素連接酶復(fù)合體,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制子蛋白(auxin/indole-3-acetic acid,Aux/IAA)的降解,將生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF(auxin response factor,ARF)從Aux/IAA-ARF二聚體中釋放出來(lái),轉(zhuǎn)錄激活生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因Aux/IAA、GH3(Gretchen Hagen 3)和SAUR(small auxin up RNA)3大家族基因表達(dá),調(diào)控植物生長(zhǎng)以及細(xì)胞增大等生理過(guò)程[5];CTK通過(guò)與細(xì)胞膜類組氨酸激酶受體蛋白1(cytokinin receptor 1 protein,CRE1)結(jié)合,被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)[6],由組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AHP)轉(zhuǎn)運(yùn)傳至細(xì)胞核內(nèi),促使B型反應(yīng)調(diào)節(jié)子(B-ARR)活化,最終激活A(yù)型反應(yīng)調(diào)節(jié)子(A-ARR)或其他靶基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控細(xì)胞分裂和幼嫩組織分化[7];GA進(jìn)入膜內(nèi)與受體蛋白(GA insensitive dwarf 1,GID1)特異性結(jié)合形成GID1-GA二聯(lián)復(fù)合體,并與DELLA蛋白結(jié)合形成GID1-GA-DELLA 三聯(lián)復(fù)合體,誘導(dǎo)DELLA蛋白的26S泛素化降解,解除對(duì)GA抑制作用,調(diào)控植物的發(fā)育[8];ABA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與受體蛋白(PYR/PYL/RCAR)結(jié)合形成二聯(lián)復(fù)合物,并與A組2C類蛋白磷酸酶(PP2C)結(jié)合,抑制其活性,而造成蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶2(SnRK2)活性的增強(qiáng),調(diào)控ABA應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ABF)活性而激活A(yù)BA生理效應(yīng)[9]。目前,植物內(nèi)源激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑已經(jīng)很清楚,但有關(guān)宿萼果與脫萼果內(nèi)源激素如何影響下游傳導(dǎo)基因的表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)在‘碭山酥梨’形成宿萼果與脫萼果的關(guān)鍵時(shí)期,比較不同外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的宿萼果與脫萼果內(nèi)源IAA、ZR、GA3和ABA的含量,并從NCBI梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢、克隆相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)基因,分析其在宿萼果與脫萼果的表達(dá)差異,旨在揭示‘碭山酥梨’幼果中內(nèi)源激素含量及其信號(hào)傳導(dǎo)基因的表達(dá)與萼片宿存與脫落的關(guān)系,為人工施用外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑提高‘碭山酥梨’脫萼果率的生產(chǎn)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘碭山酥梨’為試材,于盛花期噴施400 mg·L-1赤霉素(GA3)作為宿萼處理,噴施200 mg·L-1多效唑(PP333)作為脫萼處理,并以噴施清水為對(duì)照。每個(gè)處理3棵樹(shù),3次重復(fù)。于盛花后10 d,幼果能分辨出宿萼果與脫萼果時(shí),分別取葉片和幼果備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)源激素測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定葉片中GA3、IAA、ZR和ABA含量。

1.2.2 石細(xì)胞染色測(cè)定石細(xì)胞染色采用間苯三酚染色法。

1.2.3 總RNA提取及cDNA合成RNA提取使用StarSpin Plant RNA Mini Kit(Genstar公司),合成cDNA采用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR從NCBI梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12793)查詢、克隆獲得了IAA、GA、CTK和ABA信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的全長(zhǎng)序列,并根據(jù)獲得的序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)引物(表1),內(nèi)參采用梨GAPDH基因。

表1 用于RT-qPCR分析的引物序列Table 1 The primer sequences for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019、GraphPad Prism 8和SPSS 23統(tǒng)計(jì)軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘碭山酥梨’宿萼果與脫萼果的發(fā)育過(guò)程比較

如圖1所示:從‘碭山酥梨’盛花后10 d開(kāi)始,宿萼果與脫萼果即開(kāi)始形成(圖1-A、B),在外觀形態(tài)上已有幼果在萼筒下部出現(xiàn)離層線,即形成脫萼果,而宿萼果則沒(méi)有(圖1-C、D),此期為宿萼果與脫萼果分化關(guān)鍵期。從盛花后12 d開(kāi)始,脫萼果在萼筒離層處萼片與幼果完全分離,而宿萼果萼片與幼果正常生長(zhǎng)(圖1-E、F)。盛花后15 d,脫萼果在萼筒離層處萼片已經(jīng)完全脫落,而宿萼果萼片與幼果正常生長(zhǎng)(圖1-G、H)。盛花后165 d,‘碭山酥梨’宿萼果與脫萼果果實(shí)成熟,宿萼果萼片宿存且肉質(zhì)化,脫萼果則沒(méi)有(圖1-I、J)。成熟果實(shí)石細(xì)胞染色結(jié)果表明,宿萼果中石細(xì)胞較脫萼果多(圖1-K、L)。

圖1 ‘碭山酥梨’宿萼果(CPF)與脫萼果(CSF)的發(fā)育過(guò)程Fig.1 Development process of the calyx-persistence fruit(CPF)and calyx-shedding fruit(CSF)of ‘Dangshansuli’pearA. 盛花后10 d CPF;B. 盛花后10 d CSF;C. 盛花后10 d CPF萼片發(fā)育放大圖;D. 盛花后10 d CSF萼片發(fā)育放大圖;E. 盛花后12 d CPF;F. 盛花后12 d CSF;G. 盛花后15 d CPF;H. 盛花后15 d CSF;I. 盛花后165 d CPF;J. 盛花后165 d CSF;K. 成熟CPF石細(xì)胞染色圖;L. 成熟CSF石細(xì)胞染色圖。A. The CPF at 10 d after full bloom;B. The CSF at 10 d after full bloom;C. The CPF enlarged view at 10 d after full bloom;D. The CSF enlarged view at 10 d after full bloom;E. The CPF at 12 d after full bloom;F. The CSF at 12 d after full bloom;G. The CPF at 15 d after full bloom;H. The CSF at 15 d after full bloom;I. The mature CPF at 165 d after full bloom;J. The mature CSF at 165 d after full bloom;K. The stone cells chromatogram of mature CPF;L. The stone cells chromatogram of mature CSF.

2.2 外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘碭山酥梨’宿萼果率的影響

‘碭山酥梨’對(duì)照的宿萼果率為56.67%,400 mg·L-1GA3處理宿萼果率為100%,200 mg·L-1PP333處理宿萼果率為16.2%,且三者之間差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明外源GA3處理能顯著促進(jìn)宿萼果的發(fā)育,PP333處理顯著促進(jìn)脫萼果的發(fā)育。

2.3 ‘碭山酥梨’幼果中內(nèi)源激素含量的比較

如圖2所示:‘碭山酥梨’盛花后10 d,對(duì)照和PP333處理宿萼果中內(nèi)源IAA和GA3含量顯著高于脫萼果,GA3處理宿萼果IAA和GA3含量均顯著高于對(duì)照和PP333處理的脫萼果。不同處理宿萼果中ZR和ABA含量均與脫萼果無(wú)顯著差異。表明:在‘碭山酥梨’宿萼果與脫萼果形成的關(guān)鍵時(shí)期,宿萼果中內(nèi)源激素含量與脫萼果存在明顯的差異,且3個(gè)處理宿萼果中IAA、GA3含量顯著高于脫萼果。

圖2 外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)‘碭山酥梨’幼果中內(nèi)源激素含量的影響Fig.2 Effects of exogenous growth regulators on endogenous hormone content in young fruit of ‘Dangshansuli’pearCK. 清水對(duì)照 Water control;PP333. 200 mg·L-1 PP333脫萼處理200 mg·L-1 PP333 calyx-shedding treatment;GA3. 400 mg·L-1 GA3宿萼處理400 mg·L-1 GA3 calyx-persistent treatment.不同小寫字母表示不同處理差異顯著(P<0.05)。Different lowercases letters indicate significant difference at 0.05 level.下同。The same as follows.

2.4 ‘碭山酥梨’幼果中生長(zhǎng)素(IAA)信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)量的比較

如圖3所示:‘碭山酥梨’盛花后10 d,對(duì)照和PP333處理宿萼果中IAA信號(hào)傳導(dǎo)基因pbAUX1、pbTIR1、pbARF1、pbARF2、pbGH3.6、pbSAUR32相對(duì)表達(dá)量均顯著高于脫萼果;GA3處理宿萼果pbTIR1、pbARF1、pbARF2、pbGH3.6、pbSAUR32基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照和PP333處理的脫萼果。對(duì)照和PP333處理宿萼果中生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)基因pbAUX/IAA1、pbAUX/IAA2相對(duì)表達(dá)量低于脫萼果;GA3處理宿萼果pbAUX/IAA1基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照脫萼果的無(wú)顯著差異,但顯著高于PP333處理的脫萼果;GA3處理宿萼果pbAUX/IAA2基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照和PP333處理的脫萼果無(wú)顯著差異。表明:宿萼果中高濃度的IAA促使膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pbAUX1和核內(nèi)受體蛋白基因pbTIR1高表達(dá),生長(zhǎng)素抑制基因pbAUX/IAA1、pbAUX/IAA2表達(dá)量顯著下降,生長(zhǎng)素響應(yīng)因子pbARF1、pbARF2表達(dá)量顯著上升,激活了原初反應(yīng)基因pbGH3.6、pbSAUR32,調(diào)控宿萼果的發(fā)育。

2.5 ‘碭山酥梨’幼果中細(xì)胞分裂素(CTK)信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)量的比較

如圖4所示:‘碭山酥梨’盛花后10 d,對(duì)照和PP333處理宿萼果中CTK信號(hào)傳導(dǎo)基因pbCRE1、pbCRE2、pbCRE3、pbCRE4、pbARR1、pbARR11相對(duì)表達(dá)量均顯著高于脫萼果;GA3處理的宿萼果6個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照和PP333處理的脫萼果。而對(duì)照和PP333處理宿萼果中CTK信號(hào)傳導(dǎo)基因pbAHP1、pbAHP6相對(duì)表達(dá)量顯著低于脫萼果;GA3處理的宿萼果pbAHP6基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照和PP333處理的脫萼果。表明宿萼果中CTK膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng),但只發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其下游核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因pbAHP1、pbAHP6并未響應(yīng),核內(nèi)CTK效應(yīng)基因pbARR1、pbARR11的激活與ZR無(wú)關(guān),可能受其他激素參與調(diào)控。

圖4 ‘碭山酥梨’宿萼果與脫萼果細(xì)胞分裂素(CTK)信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)量的比較Fig.4 Comparison of the expression level on cytokinin signaling transduction genes between the CPF and CSF of ‘Dangshansuli’pear

2.6 ‘碭山酥梨’幼果中赤霉素(GA)信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)量的比較

如圖5所示:‘碭山酥梨’盛花后10 d,對(duì)照宿萼果中GA信號(hào)傳導(dǎo)基因pbGID1、pbGID2、pbGID4、pbDELLA2、pbDELLA5、pbTF5相對(duì)表達(dá)量均顯著高于脫萼果;PP333處理宿萼果pbGID1、pbGID2、pbGID4、pbTF5基因相對(duì)表達(dá)量也顯著高于脫萼果;GA3處理宿萼果pbGID1、pbGID2、pbGID4、pbTF5基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照和PP333處理的脫萼果。表明:宿萼果核內(nèi)受體蛋白基因pbGID1表達(dá)量也顯著高于脫萼果,誘導(dǎo)泛素化酶體蛋白基因pbGID2和轉(zhuǎn)錄因子pbTF5的表達(dá),參與調(diào)控宿萼果的發(fā)育。

2.7 ‘碭山酥梨’幼果中脫落酸(ABA)信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)量的比較

如圖6所示:‘碭山酥梨’盛花后10 d,對(duì)照宿萼果中ABA信號(hào)傳導(dǎo)基因pbPP2C-2、pbPP2C-50、pbSnRK2-1、pbSnRK2-2、pbABF-5、pbABF-5-5相對(duì)表達(dá)量顯著高于脫萼果;而pbPYR1、pbPYL8表達(dá)量與脫萼果無(wú)顯著差異。PP333處理的宿萼果8個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于脫萼果;GA3處理宿萼果pbPP2C-2、pbPP2C-50、pbSnRK2-2、pbABF-5-5基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照和PP333處理的脫萼果。

由于宿萼果與脫萼果中ABA含量并無(wú)明顯差異,且ABA核內(nèi)受體蛋白基因pbPYR1、pbPYR8表達(dá)量也無(wú)顯著差異,ABA抑制因子pbPP2C-2、pbPP2C-50表達(dá)量卻較脫萼果顯著增加,ABA生理效應(yīng)被抑制,說(shuō)明ABA信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)可能受IAA、GA3等激素共同調(diào)控,ABA信號(hào)傳導(dǎo)基因pbPP2C-2、pbPP2C-50、pbSnRK2-2、pbABF-5-5可能參與調(diào)控宿萼果的發(fā)育。

3 討論

研究表明,‘碭山酥梨’果心IAA含量高有利于果實(shí)萼片宿存[10-11];‘庫(kù)爾勒香梨’幼果中IAA含量高有利于果萼的宿存[12-13];‘南果梨’萼片和果心高濃度IAA有利于萼片宿存[14]。本研究中,對(duì)照與外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的‘碭山酥梨’宿萼果內(nèi)IAA含量均顯著高于脫萼果,表明梨幼果中高IAA水平有利于萼片的宿存,這與齊笑笑[4]和賈曉輝等[15]的研究結(jié)果一致。AUX1作為IAA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,對(duì)于IAA膜、核間轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮著重要作用。仇志浪等[16]研究表明,在即將脫落的甜櫻桃幼果果柄中,AUX1顯著下調(diào),說(shuō)明高AUX1基因表達(dá)水平利于組織宿存。外源IAA處理可顯著誘導(dǎo)其受體TIR1的表達(dá)[17],高表達(dá)的TIR1與活性IAA結(jié)合,介導(dǎo)IAA抑制因子AUX/IAA的降解,造成ARF解離,并調(diào)控下游基因GH3、SAUR的表達(dá)[5]。本研究中宿萼果內(nèi)pbAUX1和pbTIR1表達(dá)量均顯著高于脫萼果,而宿萼果中pbAUX/IAA1、pbAUX/IAA2基因表達(dá)量顯著下降,而pbGH3.6、pbSAUR32表達(dá)量顯著增加,與前人研究一致。Damodharan等[18]通過(guò)沉默番茄AtARF17,引起番茄花器官的脫落,證實(shí)AtARF17調(diào)控花器官的宿存。本研究表明,宿萼果內(nèi)pbARF1、pbARF2表達(dá)量均顯著高于脫萼果,可能與AtARF17功能一致,對(duì)萼片的宿存發(fā)揮著積極作用,其具體功能有待于進(jìn)一步研究。

梨果萼中高濃度GA3有利于萼片宿存[19],GA能夠延緩離體榿木莖葉的黃變[20],也可通過(guò)促進(jìn)百合切花內(nèi)源IAA的合成,延緩葉片衰老[21]。GA作為重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一,參與植物光形態(tài)建成、果實(shí)膨大等多種生理調(diào)控[22]。GA信號(hào)可以被GID1/DELLA感知,GID1表達(dá)量與赤霉素含量呈正相關(guān)[23],GID2是GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子,是介導(dǎo)DELLA蛋白降解的重要蛋白酶體編碼基因,其突變體gid2中SLRl(Slender rice 1)不能正常降解,從而抑制GA信號(hào)向下游的傳導(dǎo)[24]。本研究中,宿萼果中GA3含量與pbGID1、pbTF5基因表達(dá)量均顯著高于脫萼果,說(shuō)明GA3參與調(diào)控果萼的宿存。

CTK對(duì)葉片衰老有抑制作用,而ABA對(duì)葉片衰老有促進(jìn)作用[25]。擬南芥CTK信號(hào)途徑的ARR蛋白和ABA信號(hào)途徑的SnRK激酶互作,參與調(diào)控植物衰老過(guò)程[26]。CTK響應(yīng)因子CRF基因在AHK3被激活的條件下表達(dá)增加,對(duì)葉片衰老具有負(fù)調(diào)控作用,通過(guò)直接或間接調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn),包括響應(yīng)因子基因ARR6、ARR9和ARR11的表達(dá),進(jìn)而影響葉片衰老[27]。萼片為葉的變態(tài),具有葉片的功能。本研究中,盡管‘碭山酥梨’宿萼果中ZR、ABA含量與脫萼果無(wú)顯著差異,但CTK膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pbCRE1/2/3/4和核內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)子pbARR1/11表達(dá)量均顯著高于脫萼果;宿萼果中ABA抑制因子pbPP2C-2、pbPP2C-50表達(dá)量卻較脫萼果顯著增加,ABA生理效應(yīng)被抑制,說(shuō)明CTK和ABA等激素之間相互作用,可能間接調(diào)控宿萼果與脫萼果的發(fā)育。