張雅芬,劉亞琴,蔣明義

(南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,江蘇 南京 210095)

植物響應逆境脅迫的有效途徑之一為胞內(nèi)ABA的迅速累積,從而引起一系列的抗逆反應,例如氣孔開閉、葉片擴張速度下降、細胞滲透勢降低等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),ABA參與質(zhì)膜ATP酶和液泡膜ATP酶的修飾過程[3],可以為離子的逆向轉(zhuǎn)運蛋白提供更多驅(qū)動力。質(zhì)膜H+-ATPase是廣泛存在于植物中的一種膜蛋白。它可以水解ATP產(chǎn)生能量,把H+從細胞內(nèi)泵出到膜外,使細胞外積累大量正電荷,與細胞內(nèi)的大量負電荷形成跨膜電化學勢梯度,為離子的跨膜運輸提供能量來源[4]。H+-ATPase屬于P型ATP酶,由 1條多肽鏈組成,相對分子質(zhì)量約為1×105,擁有10個跨膜螺旋構(gòu)成的M-結(jié)構(gòu)域,以及A-、P-、N-、R-這4個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。植物對脅迫的耐性提高與植物的質(zhì)膜H+-ATPase活性增強有關(guān)。例如:鹽脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase轉(zhuǎn)運H+使細胞膜內(nèi)外的質(zhì)子濃度梯度改變,讓Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白體將細胞內(nèi)過多的Na+泵出細胞[5],從而減輕鹽脅迫對植物細胞的傷害。質(zhì)膜H+-ATPase活性會影響一些生理過程,例如:細胞擴張、營養(yǎng)吸收、營養(yǎng)易位、糖易位、氣孔控制和激素流動等[6-9]。

水稻質(zhì)膜H+-ATPase共有10個同源蛋白,OSA7為其中之一。研究表明,OSA7在所有同源基因中表達最高,且對氣孔的開放有很大影響;osa7突變體會表現(xiàn)出嚴重的生長缺陷,在生殖期到達前就會枯萎[10-11]。這些結(jié)果說明OSA7在水稻中起著至關(guān)重要的作用。bip130最初是由Hirabayashi等[12]從水稻cDNA文庫中篩選到的可能與油菜素內(nèi)酯(BR)受體BRI1互作的蛋白。目前關(guān)于bip130的報道甚少,本實驗室對bip130進行研究后發(fā)現(xiàn),ABA可誘導水稻中的bip130表達,bip130參與ABA誘導的抗氧化防護途徑[13];bip130與促分裂原活化蛋白激酶OsMPK1相互作用[14],而MAPK家族基因廣泛參與植物的脅迫響應過程[15];為了進一步探究bip130參與植物脅迫響應的作用機制,本實驗室前期利用酵母雙雜交技術(shù),以bip130為誘餌篩選到水稻中可能與bip130相互作用的靶蛋白OSA7。然而,酵母雙雜交試驗具有假陽性。本研究使用多種方法從體內(nèi)外驗證bip130與OSA7相互作用的真實性,并找出bip130與OSA7相互作用的區(qū)域以及ABA信號通路下bip130與OSA7的上、下游關(guān)系,最后探究bip130是否會調(diào)控質(zhì)膜H+-ATPase的活性,旨在為脅迫條件下bip130的作用機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白互作試驗的植物材料:粳稻(OryzasativaL.)品種‘日本晴’、本生煙(Nicotianabenthamiana)?！毡厩纭ip130-OE過表達材料以及bip130-RNAi干擾材料用于檢測質(zhì)膜H+-ATPase活性以及RT-qPCR。

1.2 酵母雙雜交試驗(Y2H)驗證蛋白互作

根據(jù)pGADT-7圖譜和OSA7序列選擇KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點構(gòu)建OSA7-pGADT-7重組載體。分別將OSA7-pGADT-7和bip130-pGBKT-7轉(zhuǎn)入酵母Y187和Y2H細胞,于SD-Leu/-Trp上融合培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)接到SD-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。收集菌液后滴定到SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal四缺培養(yǎng)基上觀察菌落是否變藍。

1.3 螢火蟲熒光素酶互補成像系統(tǒng)試驗(LCI)驗證蛋白互作

根據(jù)OSA7序列和pCAMBIA1300-nLUC載體圖譜選擇BamHⅠ和MluⅠ酶切位點構(gòu)建重組載體。將pCAMBIA1300∶nLUC-bip130和pCAMBIA1300∶OSA7-nLUC轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌后液體培養(yǎng)16～24 h,收集菌液,調(diào)整濃度,按體積比1∶1∶1將pCAMBIA1300∶cLUC-bip130、pCAMBIA1300∶OSA7-nLUC以及P19菌液混合后侵染煙草葉片。暗培養(yǎng)24 h后,光照培養(yǎng)2～3 d,噴熒光素酶底物避光反應30 min后,用光學成像儀Tanon 5200觀察熒光。

1.4 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶下拉試驗(GST pull-down)驗證蛋白互作

根據(jù)OSA7序列和pET-30a載體圖譜選擇KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切位點構(gòu)建重組載體。原核表達并純化OSA7-N-His、OSA7-C-His以及bip130-GST蛋白,將純化好的GST-bip130蛋白結(jié)合到MagneGSTTM珠子上,分別加入靶蛋白OSA7-N-His和OSA7-C-His,在垂直旋轉(zhuǎn)儀上4 ℃反應1 h。以只含有GST-bip130的MagneGSTTM珠子和攜帶GST空載體的MagneGSTTM珠子為對照。反應終止后用漂洗緩沖液清洗珠子,使用His抗體進行檢測。

1.5 雙分子熒光互補試驗(BiFC)驗證蛋白互作

根據(jù)OSA7序列以及pSPYNE載體圖譜選擇KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點構(gòu)建重組載體。將培養(yǎng)14 d的水稻幼苗的莖部切成小段放入酶解液,抽真空后黑暗低速旋轉(zhuǎn)4 h左右,收集水稻原生質(zhì)體,在顯微鏡下觀察并計數(shù),將水稻原生質(zhì)體稀釋至(1～2)×106mL-1。將pSPYCE-bip130與pSPYNE-OSA7重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體,25 ℃暗培養(yǎng)12～16 h后,將細胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.6 雙鏈RNA的體外合成與純化

在OSA7的CDS區(qū)選擇約200 bp的片段作為dsRNA模板,使用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7試劑盒(Promega)合成dsRNA。加入等體積的酚和氯仿抽提并純化,使用RNA-free水溶解后于紫外分光光度計檢測濃度。

1.7 原生質(zhì)體分離及PEG介導轉(zhuǎn)化

參照Zhang等[16]的方法,提取3葉期的水稻幼苗原生質(zhì)體:莖部切成約0.5 mm的小段,放入酶解液中黑暗抽真空1 h后,黑暗慢速搖4 h;過濾酶解后的混合液,室溫下150g離心5 min,去上清液;用原生質(zhì)體洗滌液懸浮后,150g離心5 min,去上清液;取適量原生質(zhì)體溶液滴在血球計數(shù)板上,觀察原生質(zhì)體狀態(tài)和數(shù)量;用W5溶液稀釋原生質(zhì)體至(1～2)×106mL-1。取500 μL稀釋好的原生質(zhì)體加入50 μg重組質(zhì)粒,混合均勻;加入等體積的40% PEG溶液,緩慢混合均勻至無絲狀,室溫黑暗培養(yǎng)15 min后,加入9倍體積培養(yǎng)溶液,室溫靜置5 min,150g離心3 min;棄上清液,加入500 μL培養(yǎng)液重新懸浮,室溫下150g離心 3 min;棄上清液,轉(zhuǎn)移到用小牛血清潤洗過的細胞培養(yǎng)板中,28 ℃黑暗培養(yǎng)12～16 h。

1.8 水稻總RNA提取及cDNA合成

參照Zhu等[17]的方法,將水稻根部加液氮研磨至粉狀后加入預冷的600 μL Trizol試劑充分混勻,冰浴 5～10 min;加入200 μL氯仿混勻,冰浴5 min;4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min;取400 μL上清液,轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中;加入等體積的異丙醇,充分混勻后冰浴30 min;4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,棄上清液;加入400 μL 75%乙醇洗滌沉淀,4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min;棄上清液,加入20 μL DEPC溶解總RNA,利用Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。

1.9 實時熒光定量PCR

在美國國家生物信息中心網(wǎng)站(NCBI)https://www.ncbi.nlm.nih.gov查詢OSA7及其同源基因的序列,用Primer Premier 6設(shè)計特異性引物(表1)。參照TaKaRa SYBR GreenⅠ的說明書進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)?？傮w系為20 μL:正、反引物各0.4 μL,2×SYBRPremixExTaq10 μL,50×ROX Reference DyeⅠ0.4 μL,cDNA模板1 μL,DEPC水7.8 μL。反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,95 ℃ 15 s, 40個循環(huán);60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Table 1 The primers used to quantitative real-time PCR

1.10 ABA處理下OSA7基因表達檢測

將野生型‘日本晴’水稻培養(yǎng)至3葉期后,選取長勢一致的幼苗,去傷害處理4 h后用100 μmol·L-1ABA處理水稻幼苗,分別于0、15、30、60、90、120、180和240 min迅速取樣,以同等條件下超純水處理的幼苗作為對照組。提取樣品的RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA后,進行熒光定量PCR檢測OSA7基因表達。以β-actin作為內(nèi)參,將處理0 min時的相對表達水平作為1。

1.11 OSA7瞬時表達與干擾效果的檢測

利用PEG介導轉(zhuǎn)化法將合成的OSA7dsRNA以及pXZP008-OSA7瞬時轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中,以同等條件下轉(zhuǎn)入ddH2O作為對照組。提取RNA,反轉(zhuǎn)為cDNA后,通過RT-qPCR檢測dsRNA的干擾效果以及瞬時轉(zhuǎn)化pXZP008-OSA7后OSA7基因的表達情況。

1.12 bip130與OSA7的上、下游關(guān)系檢測

以野生型‘日本晴’、bip130過表達突變體以及bip130干擾突變體為材料,用100 μmol·L-1ABA處理30 min后取樣,以同等條件下ddH2O處理幼苗作為對照,提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA后,通過RT-qPCR分析不同材料中OSA7的表達差異;利用原生質(zhì)體瞬時表達體系,在水稻原生質(zhì)體中瞬時過表達和沉默OSA7,過夜培養(yǎng)后用10 μmol·L-1ABA處理5 min,以瞬時轉(zhuǎn)入ddH2O作為對照組。提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA后,通過RT-qPCR分析不同處理中bip130的表達情況。

1.13 質(zhì)膜H+-ATPase活性測定

參考Larsson等[18]的兩相分離法提取和純化水稻葉片質(zhì)膜蛋白:取適量水稻根部,加入2倍體積預冷的研磨緩沖液,磨成勻漿后用4層紗布過濾,4 ℃、5 000g離心10 min;取上清液,4 ℃、60 000g離心 30 min;去上清液,用懸浮緩沖液重懸沉淀,加入6.3%的二相系統(tǒng),上下?lián)u勻40次后,4 ℃、4 200g離心 5 min;取上相和下相繼續(xù)進入二相系統(tǒng),分離3次后合并上相,稀釋3～5倍;4 ℃、60 000g離心30 min;取沉淀,加入懸浮緩沖液懸浮,參考Bradford[19]的方法測定水稻質(zhì)膜蛋白含量。

水稻質(zhì)膜H+-ATPase的活性測定參考Ohnishi等[20]的方法:50 μL質(zhì)膜微囊加入0.5 mL反應液,放入37 ℃水浴30 min后,加入0.5 mL 10% SDS溶液終止反應,補水至3 mL后,加入3 mL顯色液,混勻,放入37 ℃水浴保溫20 min,測定波長660 nm處的吸光值,計算無機磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 bip130與OSA7互作關(guān)系的驗證

酵母雙雜交試驗結(jié)果如圖1-A所示,在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal四缺培養(yǎng)基上,試驗組OSA7-AD/bip130-BD和陽性對照pGBKT-7-p53/pGADT-7呈現(xiàn)出藍色菌落,陰性對照pGBKT-7-lam/pGADT-7和OSA7-AD/BD、AD/bip130-BD在四缺培養(yǎng)基上沒有生長。結(jié)果說明在酵母中OSA7與bip130相互作用。GST pull-down試驗結(jié)果如圖1-B所示,OSA7-N-His蛋白和GST-bip130蛋白相互作用形成了復合蛋白,可以通過Western blot試驗檢測出OSA7-N-His的條帶,而GST空載蛋白不能與OSA7-N-His或OSA7-C-His結(jié)合,無法顯示出條帶,即證明了OSA7的N端與bip130在體外存在相互作用。

圖1 酵母雙雜交試驗(A)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶下拉試驗(B)驗證bip130與OSA7的相互作用Fig.1 Yeast two-hybird(Y2H,A)and GST pull-down(B)assay of the interaction between bip130 and OSA7

LCI試驗結(jié)果如圖2-A所示:在陽性對照OsDMI3-cLUC+OsPP45-nLUC和試驗組bip130-cLUC+OSA7-nLUC共侵染的煙草部位觀察到較強的熒光,而陰性對照OSA7-nLUC+cLUC和nLUC+bip130-cLUC沒有熒光。這說明bip130與OSA7在煙草內(nèi)存在相互作用。以水稻原生質(zhì)體為材料,利用BiFC技術(shù)驗證bip130與OSA7的相互作用(圖2-B),在激光共聚焦顯微鏡下可以清楚看到bip130-cYFP+OSA7-nYFP共轉(zhuǎn)的水稻原生質(zhì)體和OsPP45-nYFP+OsDMI3-cYFP陽性對照發(fā)出黃色熒光,而陰性對照OSA7-nYFP+cYFP和bip130-cYFP+nYFP都無發(fā)光現(xiàn)象,說明OSA7與bip130在原生質(zhì)體內(nèi)也相互作用。

圖2 螢火蟲熒光素酶互補成像系統(tǒng)試驗(A)和雙分子熒光互補試驗(B)體內(nèi)驗證bip130與OSA7相互作用Fig.2 Firefly luciferase complementary imaging system(LCI,A)and bimolecular fluorescence complementary technology(BiFC,B)assay of the interaction between bip130 and OSA7 in vivo

2.2 bip130與OSA7互作區(qū)域的驗證

在歐洲生物信息學研究所網(wǎng)站(EBI)分析OSA7的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,其中13～130 aa、227～321 aa、635～845 aa為跨膜結(jié)構(gòu)域;130～227 aa為A域超家族;323～633 aa為鹵酸脫氫酶(HAD)超家族;341～486 aa為胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域(圖3-A)。按照其結(jié)構(gòu)域的成分,將OSA7截段為1～321 aa的跨膜結(jié)構(gòu)域、341～486 aa的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域、486～633 aa的HAD超家族域、634～951 aa的跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖3 bip130與OSA7互作區(qū)域的驗證Fig.3 Identification of the interaction region between bip130 and OSA7A. OSA7蛋白結(jié)構(gòu)域分析。B. 酵母雙雜交試驗體內(nèi)驗證OSA7341～486和bip130的相互作用。C. LCI分析表明煙草葉片中OSA7的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域與bip130相互作用。A. The protein structural analysis of OSA7. B. Identification the ineraction between bip130 and OSA7341-486 by yeast two-hybrid in vivo. C. LCI assay shows that the interaction between cytoplasm N-domain of OSA7 and bip130 in tobacco leaves.

酵母雙雜交試驗結(jié)果(圖3-B)顯示,在SD-Trp/-Leu二缺固體培養(yǎng)基上所有菌落長勢良好,說明質(zhì)粒均正常轉(zhuǎn)入酵母菌中并融合成功。在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal四缺固體培養(yǎng)基上只有OSA7-AD/bip130-BD、OSA7341～486-AD/bip130-BD以及陽性對照BD-P53/AD-SV40長勢良好并呈現(xiàn)藍色,陰性對照BD-Lam/AD-SV40以及其他截段區(qū)域與bip130融合的菌落沒有生長,表明在酵母體內(nèi)bip130與OSA7的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域相互作用。LCI試驗結(jié)果(圖3-C)顯示,4組試驗圖片中陽性對照OsDMI3-cLUC+OsPP45-nLUC均正常發(fā)出熒光,試驗組中僅bip130-nLUC+OSA7341～486-cLUC發(fā)出熒光,說明在煙草葉片體內(nèi)bip130作用于OSA7的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域。

2.3 bip130與OSA7同源蛋白的關(guān)系

為了確定bip130是否也會與OSA7的同源蛋白相互作用,使用DNAMAN軟件分析OSA7與其他9個同源基因的氨基酸序列同源性,比對結(jié)果見表2和圖4。研究發(fā)現(xiàn)OSA1—OSA5與OSA7的同源性高達80%以上,因此克隆了OSA1—OSA5的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域,利用Y2H試驗和LCI試驗驗證bip130與OSA1—OSA5的關(guān)系。

表2 OSA7同源基因的分析Table 2 Analysis of OSA7 homologous genes

圖4 OSA7與同源蛋白序列間的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域比對分析Fig.4 Contrast analysis of cytoplasmic N-domain between OSA7 and homologous protein sequences

在Y2H試驗中,SD-Trp/-Leu二缺固體培養(yǎng)基上所有菌落長勢良好,說明質(zhì)粒均正常轉(zhuǎn)入酵母菌中并融合成功。在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal四缺固體培養(yǎng)基上只有陽性菌落BD-P53/AD-SV40長勢良好且呈現(xiàn)藍色,所有試驗組均無法觀察到熒光,該結(jié)果表明在酵母中OSA1—OSA5的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域與bip130不互作(圖5-A)。在LCI試驗中,僅有陽性對照OsDMI3-cLUC+OsPP45-nLUC觀察到較強的熒光,試驗組均無熒光,說明OSA1—OSA5的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域與bip130在煙草內(nèi)不存在相互作用(圖5-B)。

圖5 bip130與OSA7同源蛋白的關(guān)系Fig.5 The relationship between bip130 and OSA7 homelogous proteinsA. 酵母雙雜交技術(shù)分析bip130與OSA1—OSA5胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域的相互作用。B. 螢火蟲熒光素酶互補成像系統(tǒng)分析bip130與OSA1—OSA5胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域的相互作用。A. Yeast two-hybrid analysis of interaction between bip130 and OSA1-OSA5 cytoplasmic N-domain. B. LCI analysis of the interaction between bip130 and OSA1-OSA5 cytoplasmic N-domain.

2.4 外源ABA對OSA7基因表達的影響

從圖6可知:ABA可誘導OSA7基因表達,在30 min時到達峰值,4 h后基本回到對照組水平。這說明在水稻根部OSA7基因表達受ABA的誘導上調(diào)。

圖6 100 μmol·L-1 ABA對水稻根部OSA7基因表達的影響Fig.6 Expression analysis of OSA7 in rice roots exposed to 100 μmol·L-1 ABA treatment不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著(Duncan’s檢測法)。下同。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level according to Duncan’s multiple range test. The same as follows.

2.5 RT-qPCR分析bip130與OSA7在ABA信號通路中的上、下游關(guān)系

2.5.1OSA7的瞬時表達與沉默效果的檢測瞬時表達會顯著提高OSA7基因表達,是對照組的2.6倍;瞬時沉默效果達到70%,且OSA1—OSA5基因表達幾乎不受影響(圖7)。因此,可以使用pXZP008-OSA7質(zhì)粒和合成的dsRNA用于后續(xù)原生質(zhì)體瞬時表達和沉默OSA7的試驗。

圖7 RT-qPCR分析不同基因在原生質(zhì)體的瞬時過表達(A)和沉默OSA7效果(B)Fig.7 RT-qPCR analysis of transient expression of different gene in protoplasts(A)and silencing of OSA7(B)A. RT-qPCR分析dsRNA沉默OSA7的效果及沉默OSA7對其同源基因的影響(dsOSA7:原生質(zhì)體中瞬時沉默OSA7);B. 將pXZP008-OSA7轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體,RT-qPCR分析OSA7的過表達效果(OSA7-OE:原生質(zhì)體中瞬時過表達OSA7)。Control為野生型水稻原生質(zhì)體。數(shù)據(jù)為3個獨立試驗的平均數(shù)。下同。A. RT-qPCR analysis of the effect of dsRNA silencing OSA7 and the effect of silencing OSA7 on its homologous genes(dsOSA7:transient silencing of OSA7 in protoplasts). B. pXZP008-OSA7 was transferred into rice protoplasts and RT-qPCR was used to analyze the expression of OSA7(OSA7-OE:transient expression of OSA7 in protoplasts). Control is wild rice in protoplasts. Values are means±SE of three independent experiments. The same as follows.

2.5.2 ABA信號通路中bip130與OSA7的上、下游關(guān)系在bip130過表達材料中,OSA7表達水平明顯高于野生型水稻,ABA處理后OSA7表達水平進一步上升;bip130 RNAi突變體中,OSA7表達水平明顯低于野生型,ABA處理后OSA7表達水平略有上升。結(jié)果表明ABA信號途徑中bip130會影響OSA7的表達。在野生型原生質(zhì)體中瞬時過表達和沉默OSA7后,bip130表達水平與對照組相比無明顯差異;ABA處理后無論是瞬時過表達水平還是沉默OSA7,bip130的表達水平與對照組相比均無明顯差異(圖8)。試驗結(jié)果表明OSA7不能影響ABA對bip130的誘導?？傊?ABA信號途徑中bip130位于OSA7的上游。

圖8 RT-qPCR分析bip130與OSA7的上、下游關(guān)系Fig.8 The upstream and downstream relationships of bip130 with OSA7 analyzed by RT-qPCRA. OSA7在bip130突變體中的表達,以野生型‘日本晴’(WT)為對照,bip130-OE為bip130過表達突變體材料,bip130-RNAi為bip130 RNA干擾突變體材料。B. bip130在瞬時過表達和瞬時沉默OSA7的水稻原生質(zhì)體中的表達水平,以瞬時轉(zhuǎn)入ddH2O作為對照組(以β-actin作為內(nèi)參)。A. The expression of OSA7 in bip130 mutant,using wild type ‘Nipponbare’(WT)as control(bip130-OE:bip130 overexpression mutant material;bip130-RNAi:bip130 RNA interference mutant material). B. The expression level of bip130 in the protoplasts transiently overexpressing and silencing OSA7,transformation of ddH2O into rice protoplasts as control(using β-actin as an internal reference).

2.6 ABA信號通路中bip130對質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響

以野生型水稻為對照,水處理時,bip130-OE中的質(zhì)膜H+-ATPase活性增加,ABA處理后,增加更明顯;水處理時,bip130-RNAi中的質(zhì)膜H+-ATPase活性與野生型相比降低,ABA處理后,質(zhì)膜H+-ATPase活性上升,與未加ABA處理的野生型對比略有升高,但仍比ABA處理后的野生型水稻根部中的質(zhì)膜H+-ATPase活性低(圖9-A)。這些結(jié)果說明在ABA信號通路中bip130可以正調(diào)控質(zhì)膜H+-ATPase的活性。

bip130-RNAi材料中的質(zhì)膜H+-ATPase活性與野生型相比降低,ABA處理后活性增加但比ABA處理后的野生型活性低;與野生型相比,瞬時過表達OSA7后質(zhì)膜H+-ATPase活性明顯增加,ABA處理后活性進一步增加;在bip130-RNAi材料中瞬時過表達OSA7,發(fā)現(xiàn)該組質(zhì)膜H+-ATPase活性介于瞬時過表達OSA7組和bip130-RNAi組之間(圖9-B)。與野生型相比,在bip130過表達原生質(zhì)體中,質(zhì)膜H+-ATPase活性增加,ABA處理后活性增加更為明顯;將OSA7瞬時沉默后,質(zhì)膜H+-ATPase活性與野生型相比顯著下降,ABA處理后活性略有增加但遠低于野生型;在bip130過表達材料的原生質(zhì)體中瞬時沉默OSA7,發(fā)現(xiàn)該組質(zhì)膜H+-ATPase活性與dsOSA7組相比增加,但沒有野生型組的活性高,ABA處理后結(jié)果相似。這些試驗進一步說明在ABA信號途徑中bip130通過調(diào)控OSA7的活性而影響質(zhì)膜H+-ATPase的活性。

圖9 ABA信號途徑中bip130對質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響Fig.9 The effect of bip130 on plasma membrane H+-ATPase in ABA signaling pathwayA. 100 μmol·L-1 ABA處理對bip130突變體中質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響。B、C. 在bip130過表達突變體和沉默突變體的水稻原生質(zhì)體內(nèi)瞬時過表達和沉默OSA7后檢測質(zhì)膜H+-ATPase活性。A. The effects of 100 μmol·L-1 ABA treatment on the activity of plasma membrane H+-ATPase in bip130-OE and bip130-RNAi mutants. B,C. The activities of plasma membrane H+-ATPase in the bip130 mutant protoplasts transiently overexpress and silencing OSA7.

3 討論

質(zhì)膜H+-ATPase在逆境脅迫中具有重要作用。在鹽脅迫下,質(zhì)膜H+-ATPase將Na+主動排除在質(zhì)外體中,并由質(zhì)膜和液泡膜中特定的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運體催化,使植物在細胞質(zhì)中維持較低的Na+濃度[5]。在水分脅迫下,水稻根尖積累的ABA能夠調(diào)節(jié)根尖生長素的運輸,從而激活質(zhì)膜H+-ATPase,在根尖釋放更多的H+,維持根的伸長與根毛的發(fā)育[21]。ABA作為一種逆境激素在植物響應逆境脅迫中起著十分重要的作用。干旱與鹽脅迫下ABA可通過降低葉片氣孔導度,從而降低植物蒸騰速率以及鹽分在根冠的運輸,緩解脅迫對植物的損傷[22];ABA還可以提高脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量[23],增強離子的選擇性吸收,調(diào)控光合作用,以及加強活性氧物質(zhì)的清除等方式來調(diào)控植物代謝,使細胞由活躍的生長狀態(tài)向適應脅迫狀態(tài)轉(zhuǎn)化,最終調(diào)控植物適應外界脅迫環(huán)境。我們前期研究發(fā)現(xiàn)水稻中bip130參與ABA誘導的抗氧化防護途徑,且與促絲裂原活化蛋白激酶OsMAPK1相互作用于OsMAPK1的磷酸化激酶結(jié)構(gòu)域[14],而MAPK級聯(lián)被廣泛驗證參與ABA的信號轉(zhuǎn)導[24],說明bip130在ABA信號通路中有著重要的作用。本文通過GST pull-down、酵母雙雜交技術(shù)、螢火蟲熒光素酶互補成像系統(tǒng)和雙分子熒光互補技術(shù)證實bip130與水稻質(zhì)膜H+-ATPase 7(OSA7)互作的真實性。

質(zhì)膜H+-ATPase擁有10個跨膜區(qū)域,其N端與C端都位于細胞質(zhì)側(cè),且擁有一個大胞質(zhì)環(huán)。胞質(zhì)環(huán)可分為3個區(qū)域,分別為A、P和N結(jié)構(gòu)域。其中N結(jié)構(gòu)域包含核苷酸結(jié)合位點[25]。然而,bip130的功能域未知。為了探究bip130與OSA7具體相互作用的區(qū)域,本文分析OSA7蛋白的結(jié)構(gòu)域后將其截段為 4個區(qū)域,利用Y2H和LCI驗證bip130與OSA7的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域相互作用。為了探究bip130是否與OSA7的同源蛋白相互作用,選擇與OSA7同源性為80%的5個同源蛋白OSA1—OSA5,并克隆它們的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域,利用Y2H和LCI證明它們都不與bip130相互作用。

植物對脅迫的耐性提高與植物的質(zhì)膜H+-ATPase活性增強有關(guān)。質(zhì)膜H+-ATPase的C末端為自抑制域,H+-ATPase的激活一般是通過C末端倒數(shù)第2個蘇氨酸磷酸化后與14-3-3蛋白的結(jié)合而發(fā)生的。除了H+-ATPase的倒數(shù)第2個蘇氨酸磷酸化外,在擬南芥中AHA2的其他磷酸化位點也可以調(diào)節(jié)其活性:蛋白激酶5(PKS5)中絲氨酸/蘇氨酸Ser931的磷酸化參與AHA2的抑制[26],Thr881參與激活響應蔗糖處理[27]等。有研究發(fā)現(xiàn),第1和第4個跨膜段以及胞質(zhì)環(huán)等區(qū)域在調(diào)控質(zhì)膜H+-ATPase活性時也起作用[28],說明H+-ATPase和質(zhì)子泵活性變化的調(diào)節(jié)信號并不局限于C末端區(qū)域,也可能是通過其他區(qū)域的調(diào)節(jié)起作用。本文驗證了OSA7在胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域與bip130相互作用,且在ABA信號途徑中bip130作用于OSA7的上游。利用bip130-OE過表達材料和bip130-RNAi干擾材料對ABA處理下質(zhì)膜H+-ATPase的活性進行檢測,發(fā)現(xiàn)bip130-OE過表達植株可進一步增強ABA誘導的質(zhì)膜H+-ATPase活性,而bip130-RNAi阻止ABA誘導的質(zhì)膜H+-ATPase活性增加。本文利用水稻原生質(zhì)體瞬時表達體系在bip130-OE過表達原生質(zhì)體和bip130-RNAi干擾原生質(zhì)體中瞬時過表達和沉默OSA7后檢測質(zhì)膜H+-ATPase活性,試驗結(jié)果表明ABA信號途徑中bip130通過調(diào)節(jié)OSA7的活性而影響質(zhì)膜H+-ATPase。

綜上所述,本試驗證明在水稻中bip130僅與10個質(zhì)膜H+-ATPase中的OSA7相互作用,且作用于OSA7的胞質(zhì)N結(jié)構(gòu)域。在ABA信號途徑中bip130位于OSA7的上游,bip130可通過調(diào)控OSA7的活性而影響質(zhì)膜H+-ATPase的活性。這些研究的開展不僅可以進一步為ABA信號通路中bip130的作用機制提供理論基礎(chǔ),還能使人們對逆境下質(zhì)膜H+-ATPase活性調(diào)控機制有新的認識。