王建軍,徐園園,劉同坤,侯喜林

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

紫菜薹(BrassicacompestrisL. var.purpureaBailey)是十字花科蕓薹屬白菜亞種中的一個(gè)變種[1]。紫菜薹是我國的特產(chǎn)蔬菜,目前全國各地均有種植,它色澤紅艷、脆嫩味美、營養(yǎng)豐富,深受人們的喜愛,在蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)中占有重要地位。

紫菜薹的薹和葉中的花色苷類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、抗突變及抗病毒等生物活性[2-4],對植物的生長發(fā)育也發(fā)揮著重要作用[5]。花青素屬于黃酮類物質(zhì),是一種水溶性的天然色素,自然狀態(tài)下以花色苷的形式存在。花青素可為植物著色、保護(hù)植物免受紫外線傷害、增強(qiáng)植物對低溫脅迫的抵抗力等[6-8]。花青素具有很強(qiáng)的抗氧化性,對心血管具有保護(hù)作用,因此可被用作保健品[9]?；ㄇ嗨厣锖铣傻那绑w物質(zhì)是苯丙氨酸,在楊樹中,花青素合成是在查爾酮合酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、黃烷酮3′-羥化酶(F3′H)、類黃酮3′5′-羥化酶(F3′5′H)、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)和花青素合酶(ANS)等一系列酶的催化下完成的[10-11]?；ㄇ嗨厣锖铣苫虻谋磉_(dá)受MBW復(fù)合體調(diào)控,MBW復(fù)合體由2種轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYB和堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(bHLH)以及WD40重復(fù)蛋白組成[12-13]。bHLH49屬于bHLH家族,bHLH家族存在于多數(shù)植物體中,在擬南芥和水稻中分別有162、180個(gè)成員[14-15]。目前,在多種植物中已發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,如擬南芥中EGL3、GL3、TT8[16],番茄中SlbHLH22[17],葡萄中VvMYCA1[18]以及煙草中NtAn1和NtAn2[19]等。

本研究從紫菜薹中獲得BrbHLH49基因全長序列,對BrbHLH49進(jìn)行亞細(xì)胞定位,分析BrbHLH49基因在紫菜薹和‘四九菜心’(‘CX-49’)不同組織中的表達(dá)模式,并轉(zhuǎn)化擬南芥對其進(jìn)行功能研究,旨在探討B(tài)rbHLH49基因在花青素合成過程中的作用,為紫菜薹高花青素品質(zhì)育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為紫菜薹和不結(jié)球白菜品種‘四九菜心’(‘CX-49’),由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。待植株長至第2片真葉完全展開時(shí)取樣,液氮速凍后,于-80 ℃的超低溫冰箱中保存,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 紫菜薹BrbHLH49基因的克隆

按照RNA Simple Total RNA Kit(TaKaRa)說明書提取紫菜薹RNA,用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,作為克隆BrbHLH49基因的模板。參照文獻(xiàn)[20]的BrbHLH49(Bra004348)基因序列,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物BrbHLH49-F/R,引物序列見表1。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 BrbHLH49基因的氨基酸和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用Bioxm 2.7軟件分析基因序列的開放閱讀框(ORF)。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST對編碼的蛋白進(jìn)行同源檢索,并下載甘藍(lán)型油菜、野甘藍(lán)(原變種)、蘿卜、山萮菜、擬南芥、薺菜和醉蝶花的bHLH49氨基酸序列,利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對,用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.4 Gateway技術(shù)構(gòu)建載體

用Gateway技術(shù)構(gòu)建BrbHLH49載體[21],利用同源重組的原理,按D-TOPO試劑盒(Invitrogen)中Gateway的說明方法,進(jìn)行BP和LR反應(yīng),構(gòu)建植物過表達(dá)載體。在正向引物的5′端加上CACC序列,設(shè)計(jì)Gateway引物gateway-BrbHLH49-F/R(表1)。使用PrimerSTAR Max高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?96 ℃ 5 min;96 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30個(gè)循環(huán);4 ℃保存。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測,膠回收目的片段。參照王惠玉等[22]的方法獲得測序正確的表達(dá)載體pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP。

1.5 BrbHLH49蛋白的亞細(xì)胞定位分析

采用凍融法將驗(yàn)證后的表達(dá)載體pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中,采用Zheng等[23]農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染煙草的方法,用注射器將含有pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP的重懸菌液[終濃度為10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES(pH5.7)、150 μmol·L-1乙酰丁香酮]注射到1月齡的本氏煙草(Nicotianabenthamiana)葉片背面(避開煙草葉脈),置于人工氣候室中培養(yǎng)2～3 d后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP黃色熒光信號并拍照,分析BrbHLH49的亞細(xì)胞定位。

1.6 BrbHLH49轉(zhuǎn)基因植株的篩選

將含有過表達(dá)載體pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h;將菌液移至含有相同抗生素的液體LB培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600值為1.0;5 000 r·min-1離心5 min,收集菌體,用滲透緩沖液重懸菌體,使其D600值為0.8。用蘸花法侵染野生型擬南芥:將花序浸入滲透緩沖液,侵染1 min,每周侵染1次,共2～3次。被侵染植株收獲的種子記為T0代。將消毒后的T0代種子播種于含有潮霉素(hygromycin B)和特美汀(termetin)的MS板上,篩選出35S∶BrbHLH49-YFP的陽性苗植株即為T1代,收種后繼續(xù)篩選。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

待野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T2代長至15 d左右時(shí),用RNA Simple Total RNA Kit提取葉片的總RNA,用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并用無菌水稀釋5倍后作為RT-qPCR的模板。以PP2A為內(nèi)參基因,采用RT-qPCR測定AtCHS、AtCHI、AtDFR和AtANR基因的相對表達(dá)量,以ACTIN作為內(nèi)參基因,測定BrbHLH49的相對表達(dá)量(引物見表 1)。

以‘CX-49’作為對照,待其長至4葉期時(shí),分別提取其葉片中的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以不結(jié)球白菜ACTIN作為內(nèi)標(biāo)基因,設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(引物序列見表1),進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)體系:SYBRPremixExTaq10 μL,cDNA 1 μL,正、反引物各1 μL,ddH2O 7 μL。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

選取紫菜薹和‘CX-49’的根、薹、葉進(jìn)行BrbHLH49基因定量分析,基因表達(dá)量的測定方法同上。

1.8 花青素含量的測定

參照王小青等[24]的方法,分別取野生型和過表達(dá)BrbHLH49植株(#1)葉片(不避開葉脈,莖和葉都取)各3份,每份約為0.2 g,剪碎后用冰盒保存并迅速送至實(shí)驗(yàn)室測定樣品花色素含量。將樣品分別用含有20 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸甲醇溶液提取液于黑暗條件下浸泡24 h,期間定時(shí)搖晃,24 h后1 000 r·min-1離心10 min,取上清液,用分光光度計(jì)分別測定D530和D650值,計(jì)算花青素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜薹BrbHLH49基因的克隆

通過同源克隆的方法,從紫菜薹中克隆出BrbHLH49基因全長,序列分析表明,BrbHLH49基因含有1個(gè)長度為1 431 bp的開放閱讀框(ORF),編碼476個(gè)氨基酸,如圖1所示。

圖1 BrbHLH49基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of BrbHLH49 gene and its encoded amino acid sequence*表示終止密碼子。 * represents stop codon.

2.2 BrbHLH49氨基酸比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將BrbHLH49蛋白與7個(gè)物種的bHLH49蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對,結(jié)果(圖2-A)顯示:BrbHLH49蛋白與甘藍(lán)型油菜和野甘藍(lán)(原變種)的同源性最高,分別為91.94%和91.74%。進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖2-B)表明,BrbHLH49蛋白與甘藍(lán)型油菜和野甘藍(lán)(原變種)聚為一組,親緣關(guān)系最近。

圖2 紫菜薹與其他物種bHLH49同源氨基酸序列比對(A)及進(jìn)化樹分析(B)Fig.2 The alignment of amino acid of bHLH49 from purple tsai-tai and other plants(A) and phylogentic tree analysis(B)

2.3 BrbHLH49蛋白的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位結(jié)果(圖3)顯示,BrbHLH49-YFP形成的融合蛋白與細(xì)胞核標(biāo)記蛋白H2B-RFP重疊,表明BrbHLH49定位于細(xì)胞核上,說明其可能具有轉(zhuǎn)錄因子功能。

圖3 BrbHLH49在本氏煙草葉片中的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of BrbHLH49 in leaves of Nicotiana benthamianaH2B-RFP:核標(biāo)記紅色熒光信號The red fluorescence signals of H2B-RFP;YFP:BrbHLH49-YFP黃色熒光信號The yellow fluorescence signals of BrbHLH49-YFP.

2.4 不同組織中BrbHLH49基因的表達(dá)量分析

如圖4所示:BrbHLH49基因在不結(jié)球白菜‘CX-49’的根、薹、葉中均有表達(dá),而在紫菜薹的薹和葉中相對表達(dá)量均高于‘CX-49’,且差異極顯著,說明BrbHLH49在紫菜薹的薹和葉中高表達(dá),這與紫菜薹的薹和葉中花青素含量高相吻合。

圖4 不同組織中BrbHLH49基因的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of BrbHLH49 gene in different tissues**P<0.01. The same as follows.

2.5 BrbHLH49轉(zhuǎn)基因?qū)M南芥花青素含量的影響

將BrbHLH49轉(zhuǎn)入野生型擬南芥,共得到7株陽性苗。如圖5所示:與野生型擬南芥相比,35S∶BrbHLH49-YFP轉(zhuǎn)基因植株的莖和葉呈明顯的紫色,說明轉(zhuǎn)基因植株中明顯積累了花青素。選取紫色程度較深的#1植株T2代進(jìn)行花青素合成相關(guān)基因定量分析,結(jié)果(圖6)顯示,BrbHLH49轉(zhuǎn)基因植株(#1)中AtCHS、AtCHI、AtDFR和AtANR表達(dá)量均極顯著高于野生型。此外,野生型和轉(zhuǎn)基因植株(#1)葉片中花青素的含量分別為70和300 mg·g-1,且差異極顯著,說明過表達(dá)植株中的花青素含量明顯高于野生型植株。

圖5 野生型和35S∶BrbHLH49-YFP轉(zhuǎn)基因植株(#1、#2)表型Fig.5 Phenotypic of wild-type(WT)and 35S∶BrbHLH49- YFP(#1,#2)transgenic plants

圖6 野生型和35S∶BrbHLH49-YFP轉(zhuǎn)基因植株(#1)中BrbHLH49(A) 以及與花青素合成相關(guān)基因(B)的相對表達(dá)量Fig.6 The relative expression level of BrbHLH49(A)and anthocyanin biosynthesis genes(B) in wild-type(WT)and 35S∶BrbHLH49-YFP transgenic plants(#1)

3 討論

紫菜薹是最受人們歡迎的蔬菜之一,它的葉和莖中含有大量的花青素,因而呈紫色。結(jié)合本試驗(yàn)中BrbHLH49基因在紫菜薹莖和葉高表達(dá)的研究結(jié)果,說明BrbHLH49基因可能促進(jìn)紫菜薹中花青素的合成。因此研究紫菜薹中花青素生物合成的分子機(jī)制對高花青素紫菜薹的培育具有重要意義。

花青素由一系列結(jié)構(gòu)基因編碼的酶催化合成,再經(jīng)過各種修飾被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡等部位儲存[25]。相關(guān)基因主要被3類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控:MYB、bHLH和WDR(WD-repeat),它們主要通過形成MBW復(fù)合體來調(diào)控花青素的生物合成[26-27]。植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種生理途徑,例如光合作用[28]、氣孔開關(guān)[29]和激素應(yīng)答[30]等。研究表明,bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)多種植物花青素的合成過程,除了能正向調(diào)節(jié)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)外,還起負(fù)調(diào)控作用[15]。研究表明,蘋果中MdbHLH5和MdbHLH155能促進(jìn)花青素合成相關(guān)基因(AtF3H、AtCHS、AtCHI和AtDFR)的上調(diào)表達(dá),在花青素合成過程中起正調(diào)控作用[31];而Zhao等[32]發(fā)現(xiàn)CpbHLH1轉(zhuǎn)錄因子和 NtAN2、AtPAP1相互作用,在轉(zhuǎn)基因模式植物中表達(dá)會(huì)抑制其花色素的積累。BrbHLH49屬于bHLH家族,Li等[20]的研究發(fā)現(xiàn)‘向紅苔01’中花青素生物合成的調(diào)控可能是由于BrbHLH49基因的高表達(dá)所致,推測7號染色體上的BrbHLH49是紫色莖中花青素合成的最佳候選基因。本研究利用同源克隆的方法在紫菜薹中克隆出BrbHLH49基因,通過構(gòu)建過表達(dá)載體,亞細(xì)胞定位結(jié)果分析表明BrbHLH49定位在細(xì)胞核上,說明其可能具有轉(zhuǎn)錄因子的功能,參與調(diào)控花青素生物合成過程,與Li等[20]的研究結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)與花青素合成相關(guān)的基因AtCHS、AtCHI、AtDFR和AtANR在BrbHLH49轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均顯著高于野生型,說明紫菜薹中的BrbHLH49基因能夠促進(jìn)花青素合成相關(guān)基因表達(dá),從而促進(jìn)花青素的合成,但上調(diào)的花青素合成基因是否為BrbHLH49基因的互作靶基因仍需進(jìn)一步深入研究。