趙君,徐劍文,劉劍光,陳濤,施洋,戚永奎*,肖松華*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游棉花和油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014;2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 鹽城 224002)

向日葵(Helianthusannuus)根據(jù)用途可劃分為磕食型、油用型和觀賞型[1-2]。觀賞型葵花因其花色鮮艷多樣,廣泛用于切花、盆花、染色花、庭院美化及花境營造等領(lǐng)域[3]。植物花色的形成是多種因子協(xié)同作用的結(jié)果,涉及多種代謝物質(zhì),其中最主要的是色素。色素有許多種類,主要包括類胡蘿卜素、類黃酮和生物堿等三大類[4-6]。不同顏色的植物組織中包含的色素種類或含量不同[5],其中紫色花形成的主要色素是花青苷[6]。花青苷的生物合成是由多個(gè)酶催化完成的,編碼這些酶的幾乎所有基因均已分離,這些基因可以分成結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因,如苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合酶、MYC(myelocytomatosis)和MYB(myeloblastosis)類轉(zhuǎn)錄因子基因等[7]。鐘培星[8]研究表明,芍藥花瓣中類黃酮的組成和含量在品種間差異明顯,尤其在不同色系之間,但差異主要是由花青苷含量導(dǎo)致的。白色和黃色品種不含花青苷或含有微量的花青苷;紅紫色的品種一般含有5～8種花青苷;查爾酮是組織呈現(xiàn)黃色的重要色素。張劍亮等[9]利用質(zhì)譜分析方法分析觀賞向日葵花瓣色素的主要組分,結(jié)果表明花色素苷類化合物天竺葵色素、錦葵色素和矢車菊素及其他苷類物質(zhì)可能是花瓣呈現(xiàn)紫紅色和紅褐色的主要原因,紅花苷可能是決定觀賞向口葵花瓣呈現(xiàn)黃色或淺黃色的關(guān)鍵物質(zhì)。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段,定量分析不同顏色向日葵花器官中的代謝物質(zhì)差異,可以為今后培育不同種類觀賞向日葵提供一定指導(dǎo),為解析向日葵花色形成的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

代謝組學(xué)主要分為非靶標(biāo)代謝組學(xué)和靶標(biāo)代謝組學(xué)[10-11]。目前非靶標(biāo)代謝組學(xué)的應(yīng)用比較普遍,可以全面分析生物體內(nèi)代謝物種類,但是其存在準(zhǔn)確度不夠、特異性缺乏等缺點(diǎn)。靶標(biāo)代謝組學(xué)利用前期建立的各種代謝物數(shù)據(jù)庫,結(jié)合多種代謝通路,對(duì)目標(biāo)代謝物進(jìn)行定量分析,準(zhǔn)確度高,特異性強(qiáng),彌補(bǔ)非靶標(biāo)代謝組學(xué)的不足[12-14]。在本研究中,以2種不同花色的葵花為材料,利用靶標(biāo)代謝組學(xué)定量分析不同花色葵花中代謝物差異,并對(duì)差異代謝通路進(jìn)行富集,為不同花色葵花品種選育及葵花花色形成的分子機(jī)制解析提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘鹽葵4號(hào)’和‘鹽葵5號(hào)’是江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所自主選育的觀賞葵花品種,‘鹽葵5號(hào)’是‘鹽葵4號(hào)’種植過程中選育的自然突變株系?！}葵4號(hào)’舌狀花為純橙黃色,管狀花、雌蕊以及萼片頂端為紫色,下胚軸為紫色?！}葵5號(hào)’舌狀花為乳白色,管狀花、雌蕊以及萼片頂端為淡黃色(圖1)。以‘鹽葵4號(hào)’和‘鹽葵5號(hào)’子葉展平后地上部長度為2 cm的下胚軸(在文中紫色下胚軸被稱為紫莖,簡(jiǎn)寫為ZJ;白色下胚軸被稱為白莖,簡(jiǎn)寫為BJ)以及管狀花、雌蕊和萼片的頂端顏色存在顯著差異的部位(在文中紫色花組織被稱為紫花,簡(jiǎn)寫為ZH;白色花組織被稱為白花,簡(jiǎn)寫為BH)為材料。每個(gè)樣品分別取10株混合,放入液氮速凍后-80 ℃保存,用于代謝組分析。每個(gè)材料3次重復(fù)。

1.2 儀器及試劑

主要試劑包括甲醇(67-56-1,LC-MS級(jí),Honeywell)、甲酸(64-18-6,98%,SIGMA)、乙腈(75-05-8,LC-MS級(jí),Honeywell);主要儀器包括超高效液相色譜儀(1290 UHPLC,Agilent;XCIEX AD,AB Sciex)、高分辨質(zhì)譜儀(Q-Tof,AB Sciex)、高靈敏度質(zhì)譜儀(Q-Trap 6500,AB Sciex)、純水儀(明澈D24 UV,Merck Millipore)。其中超高效液相色譜儀使用的色譜柱為Waters公司生產(chǎn)的T3色譜柱(ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm×2.1 mm×100 mm)。

1.3 代謝物提取方法

首先將樣品冷凍干燥,利用JXFSTPRP-24研磨儀進(jìn)行研磨(60 Hz,2 min);取100 mg樣品加入到 2 mL 離心管中,加入1.5 mL提取液(甲醇、水體積比為3∶1),渦旋30 s后冰水浴超聲15 min,混勻儀上 4 ℃ 過夜后,4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min;小心吸取上清液置于2 mL進(jìn)樣瓶。每個(gè)樣品取等體積混合成QC(quality control)樣品,用于上機(jī)檢測(cè)[14]。

1.4 上機(jī)檢測(cè)及相關(guān)參數(shù)設(shè)置

使用Waters 的UPLC HSS T3 色譜柱(1.8 μm×2.1mm×100 mm),柱溫箱溫度設(shè)為40 ℃,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為4 ℃,進(jìn)樣體積為2 μL。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸乙腈溶液。色譜梯度見表1。

表1 液相色譜洗脫時(shí)流動(dòng)相條件Table 1 The conditions of mobile phase in HPLC elution

使用Q-Tof高分辨質(zhì)譜儀獲得二級(jí)譜數(shù)據(jù),構(gòu)建多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)庫(母離子與二級(jí)譜中子離子組合成的離子對(duì)),再使用Q-Trap高靈敏質(zhì)譜儀以MRM模式進(jìn)行質(zhì)譜分析得到檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)。將采集獲得的數(shù)據(jù)用本實(shí)驗(yàn)室自建的數(shù)據(jù)庫及MAPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

Q-Tof 5600+質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置如下:使用Q-Tof高分辨質(zhì)譜,通過IDA(information-dependent acquisition)模式進(jìn)行高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。數(shù)據(jù)采集軟件(Analyst)依據(jù)一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和預(yù)先設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn),自動(dòng)選擇離子并采集其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。每個(gè)循環(huán)選取12個(gè)強(qiáng)度大于100的離子。離子源參數(shù)如下:離子噴射電壓+5 500/-4 500 V,簾氣壓力35 psi,離子源溫度600 ℃,離子源氣壓60 psi,去簇電壓±100 V。數(shù)據(jù)采集時(shí)按如下mass range進(jìn)行分段:100～300、300～450、450～600、600～750、750～1 200。Q-Trap 6500質(zhì)譜儀器參數(shù)設(shè)置與Q-Tof 5600+質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置相同。

1.5 代謝物鑒定

首先用高分辨質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行超高覆蓋率的二級(jí)質(zhì)譜掃描,以獲取所有代謝物的二級(jí)譜圖(MS2),然后從中提取MRM離子對(duì)信息,對(duì)樣本進(jìn)行特異性建庫,再利用三重四極桿質(zhì)譜MRM技術(shù)進(jìn)行精確定量[15]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本研究分析時(shí)用到的數(shù)據(jù)是由原始數(shù)據(jù)矩陣處理而來。計(jì)算及數(shù)據(jù)處理方法如下:對(duì)原始數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行模擬(missing value recoding),數(shù)值模擬方法為最小值二分之一法,并利用每個(gè)樣本的總離子流(total ion current,TIC)進(jìn)行歸一化處理。

用ProteoWizard軟件將高分辨質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式,再使用MAPS軟件(XCMS內(nèi)核)進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等工作。使用自撰寫R程序包和自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。使用Skyline軟件對(duì)MRM數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[16]。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA軟件包,并進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監(jiān)督的(正交)偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)分析。依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分變量的重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值>1.0且t測(cè)驗(yàn)的P<0.05來篩選組間的差異代謝物[17-18]。利用KEGG(http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋,通過差異代謝物對(duì)KEGG、PubChem等權(quán)威代謝物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行映射,在取得差異代謝物的匹配信息后,對(duì)通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索和代謝通路分析[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析體系建立

為保證檢測(cè)過程中的儀器穩(wěn)定性,在試驗(yàn)中以QC樣品進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)。結(jié)果顯示,空白樣品無顯著峰,說明物質(zhì)殘留和樣品間的交叉污染在可控范圍內(nèi)(圖2-A),QC 樣本TIC出峰保留時(shí)間和峰面積重疊很好,說明儀器穩(wěn)定性很好(圖2-B)。不同樣品正反離子流圖如圖2-C所示,每個(gè)不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測(cè)到1個(gè)代謝物。采用無監(jiān)督的主成分分析方法,得到不同顏色葵花樣品的PCA得分圖。4組樣品的數(shù)據(jù)在PC1 維上可以明顯區(qū)分(圖2-D),3 次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)能夠較好地集中在一起,特別是莖部組織的樣品,數(shù)據(jù)點(diǎn)幾乎重合,表明在試驗(yàn)過程中數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好,其中紫莖和白莖位于同一象限,紫花和白花位于不同象限中。OPLS-DA得分(圖2-E)顯示,紫莖和白莖數(shù)據(jù)點(diǎn)幾乎重合,紫花和白花分別位于不同象限中,因此不同顏色的莖部組織比不同顏色的花組織差異小。

圖2 葵花不同組織的總離子流圖以及PCA和OPLS-DA得分圖Fig.2 Total ion current chromatograms in negative and positive ion model,and PCA and OPLS-DA score plots for the different tissues of ornamental sunflowerA. 空白樣品離子流圖;B. 質(zhì)控樣品離子流圖;C. 觀賞葵花不同樣品總離子流圖;D和E分別表示觀賞葵花不同組織PCA和OPLS-DA得分圖。A. Ion current chromatograms of the blank control sample;B. Ion current chromatograms of the quality control sample;C. Total ion current chromatograms of the different tissues of ornamental sunflower;D and E show PCA and OPLS-DA scores of different tissues of ornamental sunflower,respectively.QC:質(zhì)控Quality control;qc-01、qc-02、qc-03代表1個(gè)樣品進(jìn)行3次測(cè)定qc-01,qc-02,qc-03 represent three determinations of the same sample.

2.2 差異代謝物篩選

以‘鹽葵4號(hào)’的紫色花和紫色莖組織及‘鹽葵5號(hào)’的白色花和白色莖組織為材料，進(jìn)行靶向代謝組分析,共檢測(cè)到647種代謝物,根據(jù)OPLS-DA生成的VIP值以及t測(cè)驗(yàn)的P值來篩選組間的差異代謝物(VIP>1,且P<0.05)。紫色花顯著高于白色花的代謝物有140種,差異倍數(shù)超過5的有23種物質(zhì),其中,差異倍數(shù)最高的是山奈酚-3-O-戊糖苷,其在紫色花中含量是白色花中的3 499倍(表2)。紫色花顯著低于白色花的代謝物有224種,其中,差異倍數(shù)最高的是尿囊酸,其在白色花中尿囊酸含量是紫色花中的42 670倍。紫色莖顯著高于白色莖的代謝物有48種,其中,差異倍數(shù)最高的是5-苯基-1-戊醇,其在紫色莖中含量是白色莖中的454倍。紫色莖顯著低于白色莖的代謝物有104種,其中,差異倍數(shù)最高的是尿囊酸,其在白色莖中尿囊酸含量是紫色莖中的6 218倍。2組樣品的差異物質(zhì)在紫色莖和紫色花中同時(shí)上調(diào)的共有17種物質(zhì)(表3),在紫色莖和紫色花中同時(shí)下調(diào)的共有47種物質(zhì)。本研究重點(diǎn)關(guān)注紫色花形成的物質(zhì)代謝機(jī)制,所以對(duì)紫色花特異差異物質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步分析,結(jié)果表明,在紫色花中特異上調(diào)的物質(zhì)共有123種,紫莖中特異上調(diào)的物質(zhì)只有31種。

表2 紫色花(ZH)中代謝物含量高于白色花(BH)的種類Table 2 Metabolite species with higher content in purple flowers(ZH)than in white flowers(BH)

表3 紫色花(ZH)和紫色莖(ZJ)中代謝物含量同時(shí)上調(diào)的種類Table 3 Significantly up-regulated metabolite species in purple flower(ZH)and purple stem(ZJ)

續(xù)表3 Table 3 continued

2.3 差異代謝物的代謝通路分析

將篩選出的差異代謝物映射到KEGG通路上,并標(biāo)記在KEGG通路圖上。分析結(jié)果顯示,ZH_vs_BH差異物質(zhì)共映射到112條代謝通路,ZJ_vs_BJ差異物質(zhì)共映射到74條通路。對(duì)ZH_vs_BH上調(diào)物質(zhì)進(jìn)行富集分析,富集程度最顯著的途徑為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑,苯丙酸類化合物合成途徑,中心碳代謝,花青素合成等途徑(圖3-a);ZJ_vs_BJ上調(diào)物質(zhì)富集最顯著的途徑為花青素合成途徑、嘌呤代謝途徑、玉米素合成等途徑(圖3-b)。將紫色莖和紫色花中同時(shí)上調(diào)的17種物質(zhì)進(jìn)行富集分析,結(jié)果顯示富集程度最顯著的途徑為花青素合成途徑、恰加斯病途徑以及苯丙酸類化合物合成途徑(圖3-c)。

圖3 差異代謝物通路聚類分析Fig.3 Cluster analysis of differential metabolite pathwaya. ZH_vs_BH 上調(diào)差異代謝物通路分析;b. ZJ_vs_BJ 上調(diào)差異代謝物通路分析;c. ZH_vs_BH 和ZJ_vs_BJ共同上調(diào)差異代謝物通路分析。a. Cluster analysis of up-regulated differential metabolite pathway for group ZH_vs_BH;b. Cluster analysis of up-regulated differential metabolite pathway for group ZJ_vs_BJ;c. Cluster analysis of common up-regulated differential metabolite pathway for group ZH_vs_BH and ZJ_vs_BJ.

本研究主要是分析紫色花向日葵形成的相關(guān)代謝物質(zhì),而已有研究表明,紫色花形成的主要花色素是花青素[6],所以重點(diǎn)對(duì)花青素合成途徑進(jìn)行分析。在本研究中,差異代謝物中參與花青素合成途徑的有矢車菊素(cyanidin)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin 3-glucoside)和飛燕草素-3-O-3′,6″-O-二甲酰葡萄糖苷(delphinidin 3-O-3′,6″-O-dimalonylglucoside);本研究還分析了參與其他顏色呈色的黃酮和黃酮醇生物合成途徑中的物質(zhì),其中參與其他黃酮和黃酮醇生物合成途徑且存在差異的物質(zhì)共有5種,分別是槲皮素(quercetin)、黃芪堿(astragalin)、異槲皮素(isoquercitrin)、楊梅素(myricetin)以及蘆丁(rutin),這 5種物質(zhì)在紫花中的含量相比白花顯著下降(表4)。

表4 黃酮和黃酮醇生物合成途徑中下調(diào)代謝物質(zhì)Table 4 Down-regulated metabolites in the flavone and flavonol biosynthesis

將以上相關(guān)物質(zhì)對(duì)應(yīng)到黃酮類物質(zhì)以及花青素合成代謝通路中,結(jié)果表明部分黃酮類物質(zhì)的合成下調(diào),花青素類物質(zhì)合成上調(diào)可能是紫花花色形成的主要物質(zhì)基礎(chǔ)(圖 4)。

3 討論

廣泛靶向代謝組學(xué)是結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn),該方法基于廣泛靶向代謝組數(shù)據(jù)庫,利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模型,定性、定量檢測(cè)樣本中代謝物含量,具有高效、高靈敏、高覆蓋的特點(diǎn)[13-14]。因此,利用廣泛靶向代謝組學(xué)對(duì)植物中花色素相關(guān)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定與分析,可以深入解析植物不同花色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究中,不同顏色花組織中差異代謝物數(shù)量顯著多于不同顏色的莖組織,但是紫色組織共同上調(diào)的代謝物只有17種,這可能存在以下幾方面原因:1)不同植物組織之間代謝物含量存在較大差異。本研究的花組織樣品包括顏色存在顯著差異的管狀花、雌蕊以及萼片的頂端,是3個(gè)不同部位的混合樣品;而莖只是不同顏色的單一組織。2)不同品種間存在差異。連續(xù)多年種植結(jié)果表明‘鹽葵4號(hào)’在長勢(shì)、抗病性方面顯著優(yōu)于‘鹽葵5號(hào)’,但熟性顯著晚于‘鹽葵5號(hào)’。尿囊酸是植物氮素主要利用和儲(chǔ)存形態(tài)[21]。本研究結(jié)果顯示尿囊素含量在2個(gè)品種中存在極顯著差異,這表明,‘鹽葵5號(hào)’的氮素吸收效率要高于‘鹽葵4號(hào)’,在生長過程中植物體內(nèi)物質(zhì)的代謝速度顯著高于‘鹽葵4號(hào)’。3)花部組織顏色較莖部組織的顏色深,花部組織和莖部組織中與顏色相關(guān)代謝物質(zhì)的數(shù)量和含量存在較大差異。在比較不同差異代謝物在花和莖組織中的差異倍數(shù)時(shí),大部分差異代謝物在不同顏色的花組織中差異倍數(shù)都顯著高于不同顏色的莖組織,這表明不同顏色花組織在顏色形成過程中參與的代謝物質(zhì)數(shù)量及峰度都顯著高于莖部組織,這從矢車菊素在花部組織差異倍數(shù)顯著高于莖部組織這一結(jié)果得到驗(yàn)證。

類黃酮是控制花色的主要色素之一,其中花青苷是類黃酮的重要組成成分[8]。矢車菊素是花青苷中的主要成員,是花色素中呈現(xiàn)紫色的主要色素之一,而白色花呈色的主要色素則為“黃酮類或/和其他苷”[5]。在本研究中,紫色花和紫色莖中矢車菊素含量顯著高于白色花和白色莖中的含量,而且紫色較深的‘鹽葵4號(hào)’花組織矢車菊素含量顯著高于顏色較淺的莖部組織,而紫色花和紫色莖中部分黃酮類物質(zhì)含量顯著低于白色花和白色莖中的含量。該結(jié)果暗示‘鹽葵4號(hào)’紫色組織呈色過程中,花青素合成途徑扮演關(guān)鍵角色,矢車菊素是‘鹽葵4號(hào)’紫色組織呈色的主要物質(zhì)。山奈酚及山奈酚衍生物屬于類黃酮類物質(zhì),在植物不同組織的顏色形成過程中具有重要作用。喬雨等[22]以不同顏色的蒙農(nóng)紅豆草為材料,對(duì)不同顏色花瓣色素種類及含量進(jìn)行綜合分析,結(jié)果表明蘆丁、山奈酚-3-蕓香苷-5-鼠李糖苷和山奈酚-3-p-香豆酰葡萄糖苷為影響蒙農(nóng)紅豆草花色變化的主要成分。鐘培星等[23]以開花不同時(shí)間段花色存在顯著變化的野生芍藥為材料,定性定量分析其花色素組分,共監(jiān)測(cè)到47種類黃酮成分,其中有12種山奈酚衍生物。在本研究中,檢測(cè)到3種山奈酚類差異代謝物,分別是山奈酚-3-O-戊糖苷(kaempferol-3-O-pentoside)、山奈酚-3-O-阿拉伯吡喃糖苷(kaempferol-3-O-arabinopyranoside)、山奈酚-7-O-葡萄糖苷(kaempferol-7-O-glucoside)。這3種山奈酚類代謝物含量在不同顏色的組織中差異非常大,表明山奈酚類物質(zhì)可能在‘鹽葵4號(hào)’紫色組織形成過程中扮演重要角色,但是,目前山奈酚衍生物參與植物組織顏色形成還沒有詳細(xì)和確切的報(bào)道,因此進(jìn)一步分析山奈酚衍生物在參與植物組織顏色形成過程中的作用將是本研究今后的重點(diǎn)工作。

本研究通過代謝組學(xué)解析觀賞葵花不同組織呈色的代謝物組成差異,但是并沒有分析差異代謝物的遺傳機(jī)制。在下一步研究中,將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析,進(jìn)一步分析代謝物組成差異及花色形成的分子基礎(chǔ),為通過分子手段改良植物花色提供理論支持。