趙聚萍，羅世菊，李曉捷，武瑞娜

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264003）

海帶作為一種大型經(jīng)濟(jì)海藻，在工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用。我國是較早進(jìn)行比較系統(tǒng)的遺傳育種研究的國家, 配子體克隆技術(shù)的運用，使海帶的種質(zhì)得以長久保存，并且通過配子體雜交技術(shù)培育海帶新品種，解決了傳統(tǒng)育苗育種選育周期長、優(yōu)良性狀容易退化等問題。為了豐富育種素材，采用物理誘變等方式誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生變異，能縮短獲得優(yōu)良變異植株的時間。

目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要育種方式有：雜交育種、誘變育種、單倍體育種、多倍體育種以及基因工程育種。其中誘變育種根據(jù)作用機(jī)理的不同，主要分為化學(xué)誘變和物理誘變。X 射線、γ 射線、ARTP、紫外線和重離子等是目前進(jìn)行物理誘變的主要方法。早在20 世紀(jì)80 年代就利用重離子誘變開展初步試驗。重離子輻射屬于電離輻射的一種，其基本作用機(jī)理同X 射線和γ 射線相同，但是重離子束單位劑量的誘變效率是X 射線和γ 射線等低LET 方法的10 倍[1]。重離子輻射的突出優(yōu)勢主要表現(xiàn)在生物品種改良及選育。目前，在農(nóng)作物、微生物等方面已經(jīng)利用重離子輻射篩選獲得多個有利突變體[2-4]；重離子束輻照在條斑紫菜、海帶等大型海藻遺傳育種方面取得初步研究效果[5-7]。

現(xiàn)利用12C 重離子束對種質(zhì)庫保存的8 個配子體克隆系進(jìn)行3 次輻射試驗，通過觀察輻射后海帶配子體細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞死亡情況，判斷重離子束輻射對海帶配子體的作用范圍，以確定海帶配子體重離子輻射的適合劑量范圍，為豐富育種素材，進(jìn)一步進(jìn)行海帶重離子束輻射育種提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗材料

試驗選用的材料為山東東方海洋科技股份有限公司種質(zhì)庫中保存的海帶配子體克隆。第一次輻射材料分別為：019601016、019601001、169901002、169901003、2503 ♀混、2503 ♂混、481003002 和YDJ491004006，共8 個克隆系；第二次輻射材料分別為：019601016、019601001、2503♀混、2503♂混、481003002 和YDJ491004006 共6 個克隆系；第三次輻射材料分別為：019601016 和169901002，共2個克隆系。

1.2 試驗設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎儀、400 目篩絹、500 mL 燒杯、玻璃板、3.5 cm 培養(yǎng)皿、9 cm 培養(yǎng)皿、2 mL 凍存管、200 μL 離心管、100 mL 錐形瓶、顯微鏡等。

1.3 試驗方法

第一次試驗：將8 個克隆系的克隆用超聲波細(xì)胞粉碎儀打碎，超聲波設(shè)定功率為200 W，共超聲6 次，10 s/次，間隔時間6 s。將打碎后的克隆經(jīng)400 目篩絹過濾，得到1～4 個細(xì)胞的細(xì)胞段濾液，倒入直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中，預(yù)培養(yǎng)10 d。將預(yù)培養(yǎng)后的克隆進(jìn)行收集，裝入2 mL 的凍存管運輸，每個克隆系各裝12 支。輻射劑量為10，20，40，50 和60 Gy，每個輻射劑量2 支，對照組2 支。

第二次試驗：將6 個克隆系克隆團(tuán)直接裝入200 μL 離心管運輸，每個克隆系各裝12 管，12 管一組裝于直徑3.5 cm 的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，兩皿底對扣封口膜密封。輻射劑量為80、120、160、200 和240 Gy，每個輻射劑量2 管，對照組2 管。

第三次試驗：將2 個克隆系克隆團(tuán)直接裝入200 μL 離心管運輸，每個克隆系各裝12 管，12 管一組裝于直徑3.5 cm 的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，兩皿底對扣封口膜密封。輻射劑量為60、80、120、160 和200 Gy，每個輻射劑量2 管，對照組2 管。

試驗流能量為80 Mev，劑量率為50 Gy/min。輻射完成后，材料運回實驗室，轉(zhuǎn)入100 mL 錐形瓶內(nèi)，放入冷藏箱內(nèi)自然光下培養(yǎng)。冷藏箱溫度為8～12 ℃，每周換水、鏡檢1 次，觀察克隆狀態(tài)。

2 結(jié)果分析

2.1 第一次輻射試驗

輻射完成后，定期觀察輻射克隆。前期細(xì)胞形態(tài)、色澤與對照組比較，沒有明顯變化，不同輻射劑量之間也沒有明顯差別；170 d 鏡檢觀察輻射組細(xì)胞形態(tài)色澤，與對照組比較有變化，輻射組細(xì)胞生長不如對照組舒展，稍有些圓。180 d 鏡檢發(fā)現(xiàn)輻射對雌細(xì)胞影響較大，其中2 個60 Gy 雌克隆系個別細(xì)胞膨大、不分裂直至死亡（圖1），或者一個細(xì)胞分裂成含10 多個細(xì)胞球狀體，色素正常；雄克隆系變化不明顯；對照組克隆細(xì)胞生長狀態(tài)均正常。

圖1 海帶配子體克隆雌性

2.2 第二次輻射試驗

輻射完成后，定期觀察輻射克隆。前期細(xì)胞形態(tài)、色澤與對照組相比沒有明顯差別，各試驗組不同輻射劑量之間也沒有明顯差別。50 d 鏡檢，出現(xiàn)細(xì)胞膨大、死亡，對照組克隆細(xì)胞生長狀態(tài)好。83 d鏡檢，不同克隆系各輻射組死亡細(xì)胞明顯增多，不同克隆系間表現(xiàn)稍有差別，輻射劑量越大細(xì)胞死亡越多，160 Gy 輻射劑量下克隆系除少部分細(xì)胞生長正常，大部分細(xì)胞膨大、趨于死亡或死亡，200 和240 Gy 輻射劑量下克隆系細(xì)胞幾乎全部膨大、趨于死亡或死亡；對照組克隆細(xì)胞生長狀態(tài)均正常。180 d鏡檢，有存活細(xì)胞的輻射組逐漸恢復(fù)生長。第二批克隆存活情況見表1。

2.3 第三次輻射試驗

輻射完成后，定期觀察輻射克隆。前期細(xì)胞形態(tài)、色澤與對照組相比沒有明顯差別，不同輻射劑量的各試驗組之間也沒有明顯差別。75 d 鏡檢，輻射克隆細(xì)胞膨大、死亡，對照組克隆細(xì)胞生長狀態(tài)好。90 d 鏡檢，不同克隆系各輻射組死亡細(xì)胞明顯增多（圖2 和圖3）。110 d 鏡檢，隨輻射劑量的增大，克隆死亡情況逐漸增加，160 Gy 輻射劑量下除少部分細(xì)胞還存活，大部分細(xì)胞膨大、死亡或趨于死亡；輻射劑量200 Gy 下的克隆細(xì)胞幾乎全部膨大、死亡或趨于死亡。120 d 鏡檢，輻射劑量60 Gy 下細(xì)胞存活率約為80%～90%，輻射劑量80 Gy 下細(xì)胞存活率約為50%～60%。180 d 鏡檢，除編碼為169901002的海帶配子體克隆細(xì)胞在200 Gy 輻射劑量下沒有細(xì)胞存活，其余劑量下輻射材料均逐漸恢復(fù)生長；對照組克隆細(xì)胞生長狀態(tài)均正常。

表1 第二批海帶配子體重離子輻射后細(xì)胞存活情況

圖2 編碼為019601016 的海帶配子體細(xì)胞在不同輻射劑量下90 d 鏡檢結(jié)果

圖3 編碼為169901002 的海帶配子體細(xì)胞在不同輻射劑量下90 d 鏡檢結(jié)果

3 討論

第一次試驗考慮到重離子輻射的穿透性，先將海帶配子克隆利用超聲波打碎，預(yù)培養(yǎng)10 d，待克隆狀態(tài)恢復(fù)后進(jìn)行輻射。而第二、三次試驗為了避免超聲波打碎影響海帶配子體細(xì)胞的狀態(tài)而直接對克隆團(tuán)進(jìn)行輻射。

由試驗結(jié)果可見，利用12C 重離子束對海帶配子體克隆進(jìn)行輻射，使配子體細(xì)胞發(fā)生變化的最低輻射劑量為60 Gy；隨著輻射劑量的增大，細(xì)胞死亡增多；240 Gy 輻射劑量下，僅編碼為481003002 的海帶配子體的一個克隆系有存活，80 Gy 輻射劑量下細(xì)胞存活率約為50%～60%。

不同海帶配子體克隆系對于重離子輻射的耐受力也有差別，海帶雄配子體比雌配子體耐受力稍強(qiáng)。第二次試驗中編碼為YDJ491004006 的海帶配子體克隆各輻射劑量下細(xì)胞存活率略低于其他同輻射劑量下的海帶配子體克隆系，這可能與海帶配子體自身的狀態(tài)有關(guān)，運輸時間、溫度等因素可能對試驗結(jié)果有一定的影響。

定期觀察輻射后海帶配子體細(xì)胞的狀態(tài)。前期，海帶配子體細(xì)胞無論形態(tài)還是色澤方面與對照組相比都沒有明顯變化。約2 個月后，差異逐漸表現(xiàn)出來，有的細(xì)胞膨大、趨于死亡或死亡，而有的細(xì)胞鏡檢一直無明顯變化，細(xì)胞形態(tài)、色澤均正常，但能因輻射受到損傷不分裂不生長，最終死亡。

4 結(jié)論

通過3 次重離子束輻射海帶配子體克隆試驗，可大體判斷重離子束輻射對海帶配子體起作用的劑量為60～240 Gy。

重離子輻射可能誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生大量變異，對輻射后的海帶配子體克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、育苗，期待能在較短時間內(nèi)獲得具有優(yōu)良性狀的變異植株，分離、保存與優(yōu)良性狀相關(guān)的新基因；還可以結(jié)合海帶配子體克隆細(xì)胞雜交技術(shù)獲得數(shù)量多、種類多的突變植株[7]。同時，利用海帶配子體克隆培養(yǎng)方法分離和培養(yǎng)目標(biāo)植株的配子體細(xì)胞，可以作為新的海帶遺傳資源進(jìn)行保存，豐富海帶種質(zhì)資源庫。