馬捷汀，羅 剛

(1.上海市政工程設(shè)計(jì)研究總院(集團(tuán))有限公司，上海 200092； 2.復(fù)旦大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200438)

印染行業(yè)排放大量廢水，經(jīng)傳統(tǒng)二級生化處理工藝后的出水基本上其化學(xué)需氧量(Chemical Oxygen Demand， COD)和總氮(Total Nitrogen， TN)兩項(xiàng)指標(biāo)均不能滿足《紡織染整工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)(GB 4287—2012)》的要求[1].生化處理出水COD值反映了難以生物降解的有機(jī)污染物含量，理論上不宜簡單重復(fù)使用生物處理法對其進(jìn)行去除；總氮指標(biāo)則主要反映了硝態(tài)氮含量，低濃度硝態(tài)氮在技術(shù)上只能依靠生物反硝化方法，但生化出水缺乏優(yōu)質(zhì)碳源，殘存的有機(jī)物甚至可對生物反硝化產(chǎn)生毒性作用[2].

本文研究了鐵屑、Cu/Fe雙金屬促進(jìn)生物反硝化的效果，揭示其促進(jìn)機(jī)制.結(jié)合三維熒光光譜(3D-EEM)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)及UPLC-QTOF等手段研究零價(jià)鐵促進(jìn)生物反硝化工藝中有機(jī)物的變化特征，掌握零價(jià)鐵促進(jìn)生物反硝化工藝有機(jī)物的影響.同時(shí)，采用宏基因組測序手段，研究零價(jià)鐵促進(jìn)生物反硝化工藝中微生物群落和功能菌群的演替規(guī)律，闡明零價(jià)鐵促進(jìn)生物反硝化的微生物學(xué)機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 兩種鐵基材料系統(tǒng)組成

本研究采用兩種鐵基材料系統(tǒng)： ① 鐵屑，僅為鐵刨花構(gòu)成.除了零價(jià)鐵的還原作用外，鋼材中均有固定含量的其他金屬和碳元素，可通過微電解的方式發(fā)揮電化學(xué)還原作用.② Cu/Fe雙金屬.通過化學(xué)鍍在鐵屑表面鍍少量的單質(zhì)銅，形成雙金屬體系Cu/Fe.由于陰極銅的存在，強(qiáng)化陽極鐵的還原能力，因而體系中可發(fā)生宏觀的電化學(xué)還原作用.本試驗(yàn)選取鐵刨花規(guī)格如下： 材質(zhì)為中國GB標(biāo)準(zhǔn)鋼號45#鋼，刨花來自寶山路金屬機(jī)械加工廠.含碳(C)量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))是0.42%～0.50%，其他金屬含量： Si為0.17%～0.37%；Mn為0.50%～0.80%；Cr≤0.25%；Ni≤0.30%；Cu≤0.25%.試驗(yàn)采用的鐵刨花為金屬零件加工時(shí)車床切削下來的廢鐵屑，鐵刨花呈螺旋狀彎曲，長約20 cm，比表面積約82 cm2/g.為了便于在小試中使用，試驗(yàn)前將鐵刨花剪碎為長寬約為1 cm的碎片，按量取用.制備Cu/Fe雙金屬： 配置5%濃度的五水硫酸銅(質(zhì)量濃度，以CuSO4·5H2O計(jì))溶液，按照Cu/Fe質(zhì)量比為0.3%的比例，取適量的鐵屑完全浸泡在適量的溶液中，放入搖床中振蕩2 h，使其化學(xué)置換反應(yīng)充分進(jìn)行，鍍銅結(jié)束后用去離子水淋洗數(shù)遍，備用.

1.2 試驗(yàn)裝置與試驗(yàn)過程

采用序批式反應(yīng)器(SBR)運(yùn)行.連續(xù)流試驗(yàn)裝置反應(yīng)器總體積6 L、有效體積4.8 L.共有3個.其中兩個反應(yīng)器采用鐵基材料強(qiáng)化生物反硝化，其中Fe-SBR中加入鐵屑，Cu/Fe-SBR中加入Fe/Cu雙金屬，一個反應(yīng)器不添加鐵基材料，作為對照試驗(yàn).試驗(yàn)裝置由3部分構(gòu)成： SBR反應(yīng)器主體、時(shí)間控制系統(tǒng)和氣體收集系統(tǒng).SBR周期為360 min，每周期程序?yàn)椋?反應(yīng)器進(jìn)水5 min,攪拌320 min,靜置30 min,出水5 min.攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為120 r/min.在3個反應(yīng)器每運(yùn)行周期進(jìn)出水0.8 L，有效反應(yīng)體積4.8 L，水力停留時(shí)間為10～12 h.

采用印染廢水二級生物處理并經(jīng)催化臭氧氧化后的出水作為鐵基材料強(qiáng)化生物反硝化工藝的原水，印染廢水經(jīng)催化臭氧氧化工藝后的出水水質(zhì)為： COD約為71 mg/L，TN約為58.7 mg/L，硝態(tài)氮約為58.3 mg/L，pH約為7.8.

3個序批式反應(yīng)器(SBR)分別為鐵屑反應(yīng)器(Fe-SBR)、Cu/Fe雙金屬反應(yīng)器(Cu-Fe-SBR)、生物對照反應(yīng)器(SBR)，預(yù)先培養(yǎng)馴化45 d后，反應(yīng)器中MLSS分別在2.6，2.3，2.4 g/L.

1.3 有機(jī)物特征分析

1.3.1 有機(jī)物分子量分布測定方法

水樣經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行分子量分布測定.根據(jù)張洪流等[6]和王安杰等[7]的方法，選取高效液相色譜儀(HPLC， Agilent 1200， USA)，色譜柱為Agilent PL aquagel-OH 30 column(300×7.5 mm,8 μm)，柱溫為25 ℃；流動相組成為0.001 mol/L NaH2PO4、0.001 mol/L Na2HPO4和0.03 mol/L NaCl，流速為0.5 mL/min；選用二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長為254 nm，帶寬為100 nm.保留時(shí)間和分子量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過測定標(biāo)準(zhǔn)試劑盒而確定.

1.3.2 三維熒光光譜測定方法

3D-EEMs采用三維熒光光譜儀(HORIBA Jobin Yvon FluoroMax-4， France)進(jìn)行測定分析.以超純水為空白，水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后稀釋5倍進(jìn)行測定.熒光光譜儀的設(shè)置條件如下： 激發(fā)和發(fā)射模式的狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長Ex以5 nm的間隔從240 nm遞增到450 nm，發(fā)射波長以5 nm的間隔從250 nm遞增到550 nm，掃描速度為1 200 nm/min.數(shù)據(jù)采用OriginPro 8軟件進(jìn)行處理.

1.3.3 有機(jī)物種類分析方法

本研究采用GC-MS和UPLC-QTOF兩種方法進(jìn)行有機(jī)物種類分析.

GC-MS法根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法》[8]進(jìn)行樣品制備和分析，具體操作步驟如下： 先向1 L經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后的水樣中加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至大于11，分別用60 mL二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷；再加入H2SO4溶液調(diào)節(jié)水樣pH值至小于2，分別用60 mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷相；加入少量無水硫酸鈉除水后蒸發(fā)濃縮至10 mL，再氮?dú)獯得撝?.5 mL以下，用二氯甲烷定容至0.5 mL，進(jìn)行GC-MS(Shimadzu GCMS-QP2010 SE， Japan)分析，色譜柱為HP5-MS，起始溫度40 ℃保持4 min，以10 ℃/min升溫至270 ℃.每個化合物的峰面積和相對峰面積(%)根據(jù)Wu等[9]報(bào)道的方法進(jìn)行計(jì)算.

UHPLC-QTOF的分析方法具體如下： 采用UPLC-QTOF(Agilent 1290 UPLC， Agilent 6540 QTOF)，在30 ℃條件下使用Agilent ZORBAX SB-C18 HD色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)以0.25 mL/min的流速進(jìn)行色譜分離.質(zhì)荷比范圍為50～3 000 m/z，掃描頻率為2譜/秒.

1.4 菌群結(jié)構(gòu)分析

取鐵屑反應(yīng)器(Fe-SBR)、Cu/Fe雙金屬反應(yīng)器(Cu-Fe-SBR)和生物對照反應(yīng)器(SBR)3個反應(yīng)器貧碳源反硝化所用污泥混合液相及靜沉?xí)r污泥樣，進(jìn)行宏基因組測序分析.鐵屑反應(yīng)器(Fe-SBR)、Cu/Fe雙金屬反應(yīng)器(Cu-Fe-SBR)和生物對照反應(yīng)器(SBR)中混合液相樣品分別命名為Fe，F(xiàn)e-Cu和C，而空白組中沒有取污泥樣，鐵屑反應(yīng)器(Fe-SBR)和Cu/Fe雙金屬反應(yīng)器(Cu-Fe-SBR)污泥樣分別命名為Fe-S和Fe-Cu-S.

1.4.1 DNA提取

DNA提取采用FAST DNA 提取試劑盒(MP Biomedicals, USA)，并按照試劑盒操作說明提取DNA.所提DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000進(jìn)行質(zhì)檢和濃度測定.DNA樣品保存在-80 ℃冰箱中.

1.4.2 宏基因組測序與分析

(1) 宏基因組的測序流程

a.環(huán)境樣品DNA抽提，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA；b.片段化： 約300 bp(儀器： Covaris M220)；c.構(gòu)建PE文庫(試劑： TruSeqTMDNA Sample Prep Kit)；d.橋式PCR(試劑： cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS)；e.Illumina Hiseq測序(試劑： Truseq SBS Kit v3-HS(200 cycles)).

(2) 基因序列聚類

將所有樣品預(yù)測出來的基因序列，用CD-HIT軟件(http:∥www.bioinformatics.org/cd-hit/)進(jìn)行聚類(參數(shù)為： 95% identity、90% coverage)，每個類取最長的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集.

(3) 基因豐度計(jì)算

使用SOAPaligner軟件(http:∥soap.genomics.org.cn/)，分別將每個樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對(95% identity)，統(tǒng)計(jì)基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息.

(4) 物種分類學(xué)注釋

使用BLASTP(BLAST Version 2.2.28+，http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(BLAST比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5)，并通過NR庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋，然后使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度，并在Domain(域)、Kingdom(界)、Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)、Species(種)各個分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種在各個樣品中的豐度，從而構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度譜(abundance profile).

(5) COG功能注釋

使用BLASTP(BLAST Version 2.2.28+，http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集序列與eggNOG(evolutionary gen-ealogy of genes： Non-supervised Orthologous Groups，http:∥eggnog.embl.de/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(BLAST比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5)，獲得基因?qū)?yīng)的COG(Clusters of Orthologous Groups of Proteins，直系同源序列聚類)，然后使用COG對應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該COG的豐度.

(6) KEGG功能注釋

運(yùn)用BLAST(BLAST Version 2.2.28+，http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集序列與KEGG的基因數(shù)據(jù)庫(GENES)進(jìn)行比對，BLAST比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5.根據(jù)比對結(jié)果使用KOBAS 2.0(KEGG Orthology Based Annotation System，http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)進(jìn)行功能注釋.使用KO、Pathway、EC、Module對應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該功能類別的豐度.

1.5 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)測定

試驗(yàn)過程中對常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)，如COD，N，P等指標(biāo)進(jìn)行周期性采樣監(jiān)測，采樣頻率為每周2次；操作指標(biāo)如流量、壓力及溫度等每天監(jiān)測；污泥特性中污泥濃度(混合液懸浮固體濃度/混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度，MLSS/MLVSS)的測定頻率為每周2次，鏡檢則視污泥狀態(tài)選擇.測定指標(biāo)和分析方法如表1所示.

表1 項(xiàng)目與分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)器性能

圖1 3個反應(yīng)器的性能Fig.1 Performance of the three reactors

Fe-SBR和Cu-Fe-SBR反應(yīng)器的TN去除率分別穩(wěn)定在30%和20%左右，高于SBR反應(yīng)器的12%.通過進(jìn)水和出水的氮質(zhì)量平衡分析發(fā)現(xiàn)，3個反應(yīng)器出水TN濃度的變化與硝態(tài)氮濃度的變化一致，硝酸鹽在進(jìn)水和出水中都是主要成分，而且亞硝態(tài)氮(<5 mg/L)和氨氮(<1 mg/L)的濃度都很低.這說明，TN的去除主要通過硝酸鹽反硝化來實(shí)現(xiàn).SBR反應(yīng)器具備一定的反硝化功能，這也說明催化臭氧氧化出水中的部分有機(jī)物仍可用被異樣微生物利用.

在后期穩(wěn)定的情況下，SBR、Fe-SBR和Cu-Fe-SBR反應(yīng)器出水COD濃度均低于40 mg/L.Fe-SBR和Cu-Fe-SBR反應(yīng)器的出水碳氮比小于1，低于理論上反硝化所需的碳氮比(3.7)[3]，說明零價(jià)鐵作為電子供體參與了反應(yīng).值得注意的是，印染廢水中存在著抑制生物反硝化的有機(jī)物和重金屬，Cu/Fe雙金屬還原能力強(qiáng)于鐵屑，加入后Fe和Cu可以與高價(jià)重金屬離子發(fā)生置換反應(yīng)，從而減輕重金屬對微生物的抑制作用，這或許解釋Cu/Fe雙金屬促進(jìn)反硝化的機(jī)理.3個反應(yīng)器出水均殘余一定的COD，說明原水COD包含部分難降解有機(jī)物不能被生物反硝化菌利用.從出水水質(zhì)來看，F(xiàn)e-SBR反應(yīng)器和Cu-Fe-SBR反應(yīng)器能夠獲得更好的脫氮效果，并且可以促進(jìn)難生物降解COD的去除.

連續(xù)運(yùn)行120 d后，3個反應(yīng)器MLSS和MLVSS情況如圖2所示.Fe-SBR和Cu-Fe-SBR中MLSS為對照SBR(1 967 mg/L)的2.5倍左右，MLVSS為對照SBR(1 295 mg/L)的1.5倍左右.因此，零價(jià)鐵的加入，給反應(yīng)器中的微生物提供了更為適宜的生長環(huán)境，使Fe-SBR和Cu-Fe-SBR兩個反應(yīng)器的污泥總量和揮發(fā)性污泥總量得到較大增長，同時(shí)也有助于提高反應(yīng)器抗沖擊負(fù)荷和生物毒性的能力.由于鐵離子的混凝作用，使得污泥的沉降和濃縮性能得到明顯改善，但大量零價(jià)鐵的投入導(dǎo)致反應(yīng)器中污泥含有大量鐵的化合物，使得MLVSS/MLSS之比值較生物對照組有大幅度下降，分別為0.38與0.63.

圖2 反硝化反應(yīng)器中MLSS與MLVSSFig.2 MLSS and MLVSS in the denitrification reactors

2.2 零價(jià)鐵對反應(yīng)器DO與ORF的影響

DO的濃度是決定生物反硝化速率的關(guān)鍵因素之一，反應(yīng)器內(nèi)殘余的DO會優(yōu)先作為電子受體參與生化反應(yīng)，從而阻礙硝酸鹽還原，而且絕大多數(shù)反硝化菌均為厭氧微生物.因此，缺氧甚至厭氧環(huán)境是生物反硝化反應(yīng)所必須的環(huán)境，夠始終控制反應(yīng)中DO的濃度在一個較低的水平是保證生物反硝化實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié).測定各反應(yīng)器中DO水平為： 2.54 mg/L(進(jìn)水)；0.56 mg/L(Fe-SBR)，0.63 mg/L(Cu-Fe-SBR)，1.21 mg/L(SBR).可見，零價(jià)鐵的存在可以有效降低反應(yīng)器混合液中的DO，使進(jìn)水后DO濃度迅速降至1.0 mg/L以下，創(chuàng)造有利于生物反硝化進(jìn)行的環(huán)境.

由圖3可知，相比于對照SBR，F(xiàn)e-SBR和Cu-Fe-SBR中的ORP自反應(yīng)開始便快速下降，最低可至-385 mV和-338 mV，反應(yīng)器內(nèi)已接近完全的厭氧狀態(tài)(-400 mV).試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，ORP電極越靠近鐵刨花骨架，測到的ORP越低，說明ORP的快速降低主要是由鐵表面的腐蝕引起的，這與文獻(xiàn)所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致[5].這說明鐵在反應(yīng)器中會作為電子供體參與發(fā)生氧化還原反應(yīng)，消耗反應(yīng)器中的DO，從而使水溶液中ORP快速持續(xù)下降，為反硝化菌群創(chuàng)造缺氧環(huán)境從而提高生物反硝化效率.

2.3 鐵基材料強(qiáng)化生物反應(yīng)器產(chǎn)生的價(jià)態(tài)鐵

在連續(xù)流反應(yīng)器中，當(dāng)攪拌停止、靜沉開始時(shí)取水樣，過濾后總鐵均很低，未測亞鐵.

污泥樣品含鐵量測定： 取出100 mL泥水混合液過濾，并在105 ℃下烘干2 h，稱重.再將得到的干污泥在600 ℃下灼燒0.5 h，剩余殘?jiān)名}酸溶解并用啉菲啰林分光光度法測定總鐵量，最終計(jì)算出污泥中鐵的百分含量.測定結(jié)果： Fe-SBR污泥樣品含鐵量為42 mg/g(以Fe計(jì))，Cu-Fe-SBR污泥樣品含鐵量為79 mg/g(以Fe計(jì)).

零價(jià)鐵在反硝化過程中被氧化，首先氧化為Fe2+，絕大部分Fe2+在溶液中被氧化，成為Fe3+后發(fā)生化學(xué)沉淀反應(yīng)，在活性污泥的助凝下，與活性污泥一起沉淀.因此，零價(jià)鐵強(qiáng)化生物系統(tǒng)在長期運(yùn)行中消耗的零價(jià)鐵，基本轉(zhuǎn)移到污泥中，成為三價(jià)鐵化合物；而溶液中亞鐵濃度很低，小于1 mg/L.Fe-SBR和Cu-Fe-SBR混合液出水中總鐵濃度分別為10.2 mg/L和10.6 mg/L.在過濾后，總鐵濃度將為0.54 mg/L和0.58 mg/L.說明混合液中的總鐵主要為三價(jià)鐵膠體和懸浮物.而在水體中主要為Fe3+，含量較低.因此，零價(jià)鐵強(qiáng)化生物反硝化系統(tǒng)不會導(dǎo)致出水鐵離子的大幅度增加，作為處理工藝應(yīng)用時(shí)不會引起二次污染.

2.4 反應(yīng)器出水有機(jī)物特性分析

2.4.1 三維熒光光譜分析

將3個反應(yīng)器出水水樣進(jìn)行三維熒光光譜分析，觀察反硝化后有機(jī)物組分的變化情況，測定結(jié)果如圖4所示.原水在Em/Ex=275/325處有一個熒光峰(圖4(a))，該峰為溶解性微生物代謝產(chǎn)物(SMP)的熒光特征峰.SMPs一般可分為與基質(zhì)利用有關(guān)的產(chǎn)物(UAP)和與微生物有關(guān)的產(chǎn)物(BAP)生長有關(guān),其中UAP與基質(zhì)代謝及微生物生長有關(guān)，其產(chǎn)生的速率與基質(zhì)利用率成正比；BAP與微生物的內(nèi)源代謝有關(guān)，其產(chǎn)生的速率與微生物的濃度成正比[10].Cu-Fe-SBR出水和Fe-SBR出水均在此處有熒光峰(圖4(b)、(c))，可見反應(yīng)過程對于此類物質(zhì)不再有進(jìn)一步去除的效果，這類有機(jī)物不能作為生物反硝化的碳源，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相符合.值得注意的是，Cu-Fe-SBR出水的SMP特征峰強(qiáng)度更大.通常，重金屬是微生物生長代謝必須的微量元素，但在污水生物處理系統(tǒng)中，重金屬離子濃度過高則會導(dǎo)致微生物活性收到抑制，影響工藝的運(yùn)行效果.SMP中包含大量螯合基團(tuán)(例如羥基、羧基和氨基等)，這些基團(tuán)能夠與水中的重金屬離子(如Cu2+、Pb2+、Cr3+等)發(fā)生螯合從而減輕金屬離子對微生物的毒性，但同時(shí)也能增加(螯合鍵弱)金屬離子的生物有效度[11].因此，Cu/Fe雙金屬投入正是通過提高反應(yīng)器中金屬離子的生物有效濃度，從而極大促進(jìn)厭氧微生物的代謝活性.

圖4 反應(yīng)器出水的三維熒光光譜圖Fig.4 3D-EEM fluorescence spectrum of reactors effluent

對照組除了在Em/Ex=275/325處有熒光峰外，在Em/Ex=250/425處也有一個熒光峰，此熒光峰代表富里酸類物質(zhì).上述結(jié)果表明，Cu-Fe-SBR出水和Fe-SBR出水中的有機(jī)物相較于對照組的傳統(tǒng)生物工藝，從結(jié)構(gòu)上有了很大的變化.在強(qiáng)度方面，對照組的富里酸類熒光峰強(qiáng)度大于了原水強(qiáng)度，可能是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的其他腐殖質(zhì)經(jīng)部分生物氧化所致.此外根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在有二價(jià)態(tài)金屬存在下，富里酸比腐殖酸更容易被厭氧污泥中的微生物所吸附，其本身又可以充當(dāng)微生物碳源，因此被微生物加以利用[12].顯然，Cu-Fe-SBR出水和Fe-SBR出水中富里酸特征峰均消失，證明Cu2+與Fe2+的存在都可以促進(jìn)富里酸的生物吸附.

2.4.2 有機(jī)物極性分析

反硝化過程中，有機(jī)物組分的降解與變化采用UPLC-QTOF的分析法，檢出原水中的極性有機(jī)物種類達(dá)203種，其中，有92%的有機(jī)物保留時(shí)間小于2 min，剩余8%的有機(jī)物保留時(shí)間大于2 min.根據(jù)測定時(shí)的流動相條件，可認(rèn)定為有機(jī)物保留時(shí)間小于2 min的為強(qiáng)極性有機(jī)物，既是水中溶解性強(qiáng)的有機(jī)物；有機(jī)物保留時(shí)間大于2 min則為中等極性或弱極性有機(jī)物.而Cu-Fe-SBR出水和Fe-SBR出水和對照SBR出水所檢出的極性有機(jī)物數(shù)量不盡相同，分別為576種、547種和580種(表3).強(qiáng)極性有機(jī)物的比例也大約為92%，中等極性或弱極性有機(jī)物約占8%.

表3 各水樣中極性有機(jī)物數(shù)量

2.4.3 有機(jī)物種類分析

如表4所示，原水中多糖的濃度分別為15.8 mg/L，根據(jù)化學(xué)計(jì)量因子計(jì)算，1 mg/L多糖的COD當(dāng)量為1.2 mg/L.因此，原水中多糖的COD當(dāng)量濃度為18.9 mg/L，占原水SCOD濃度的比達(dá)高達(dá)62.4%.經(jīng)過反應(yīng)器處理240 min后，F(xiàn)e-SBR出水多糖濃度降低至4.43 mg/L，Cu-Fe-SBR出水降低至3.00 mg/L，對照SBR降低至4.17 mg/L，3個反應(yīng)器中多糖的去除率分為72.0%，81.0%和73.6%.從出水SCOD可以看出，多糖在SCOD中所占比下降，Cu-Fe-SBR出水中多糖占SCOD的比例最低，為20.3%；Fe-SBR出水SCOD中多糖占比27.7%；以上兩者均低于對照SBR的34.7%.可見鐵基材料強(qiáng)化生物反應(yīng)器中生化反應(yīng)有其自己的特點(diǎn).

表5列出了原水及Fe-SBR、Cu-Fe-SBR和對照SBR 3個反應(yīng)器出水中采用GC-MS法所檢測到的主要半揮發(fā)性小分子有機(jī)物的種類及其相對含量.

表5 不同反應(yīng)體系出水中GC-MS檢出的主要小分子有機(jī)物種類

原水分別經(jīng)3個SBR厭氧處理后，原水中主要的半揮發(fā)性小分子有機(jī)物都得到了較好的去除，其中包括2-(2-N-Benzyl-N-methylaminoethyl)、1-Dodecanamine,N,N-dimethyl-、2-Propanone、Eicosamethylcyclode-casiloxane等.與此同時(shí)，體系中有新的有機(jī)物生成，1-Phenanthrenecarboxylic acid和2,2,4,7,7-Pentamethyl-3,6-dioxa-2,7-disilaoctane是兩種只在出水中被檢出的新物質(zhì)，可能是微生物合成代謝的產(chǎn)物[11].

SMPs產(chǎn)生自二級生物處理過程，是二級出水有機(jī)物的主要組成.鐵基材料強(qiáng)化生物反硝化體系對于可能的SMPs物質(zhì)有更好的去除效果，而且鐵基材料強(qiáng)化生物反硝化體系對于化工制品類有機(jī)物的去除效果更好，這可能是由于鐵基材料反應(yīng)生成鐵的羥基化合物具有一定的物化處理作用[13].相比之下，生物對照SBR出水中n-Hexadecanoic acid的總量和相對含量上升，而且對原水中化工制品類有機(jī)物的去除效果較差一些.

2.5 反硝化的分子生物學(xué)分析

2.5.1 反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)

基于宏基因組學(xué)的微生物群落組成如圖5所示.由圖中可以看出Proteobacteria在所有樣品中都占優(yōu)勢(47%～80%).和C相比，F(xiàn)e中Bacteroidetes得到富集，而Fe-Cu中Actinobacteria得到富集，以上結(jié)果表明Fe或者Fe-Cu的加入會改變混合液中微生物群落結(jié)構(gòu)，但是Fe和Fe-Cu的投入對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響并不相同.Fe-S及Fe-Cu-S的Proteobacteria得到了富集(80%左右)，其明顯高于其他樣品(<60%)，這可能與其表面形成生物膜，因此微生物停留時(shí)間更久所以使得微生物群落相比于混合液中發(fā)生了明顯的改變.

圖5 微生物群落組成Fig.5 The composition of the microbial community

屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖5，從中可以看出Gallionella和Arenimonas在Fe-S和Fe-Cu-S上得到了明顯的富集，這兩類微生物都是可以自養(yǎng)呼吸實(shí)現(xiàn)反硝化的[14-15]，進(jìn)一步表面Fe和Fe-Cu表面自養(yǎng)微生物得到了富集用以實(shí)現(xiàn)脫氮.和C相比，F(xiàn)e中Dokdonella得到富集，而Fe-Cu中Mycobacterium得到富集，然而目前的文獻(xiàn)并未報(bào)道這兩種微生物可以實(shí)現(xiàn)自養(yǎng)反硝化，這兩類微生物在Fe和Fe-Cu中的富集目前還不清楚原因.

2.5.2 反硝化中功能基因組成

為進(jìn)一步了解微生物群落的功能，對序列進(jìn)行了COG注釋，不同樣品其序列可以得到注釋的比例不同，分別為C 18.5%，F(xiàn)e 16.5%，F(xiàn)e-Cu 13.6%，F(xiàn)e-S 26.4%，F(xiàn)e-Cu-S 31.2%，這個結(jié)果表明Fe和Fe-Cu表面的微生物可以得到更多的注釋.COG分析結(jié)果如圖6所示，從中可以看出5個樣品的COG功能分類較為接近，大部分功能基因集中在Energy production and conversion， Amino acid transport and metabolism， Replication, recombination and repair, Cell wall/membrane/envelope biogenesis.盡管C反應(yīng)器中未含有Fe或者Fe-Cu, 但其微生物樣品中屬于Inorganic ion transport and metabolism的序列的比例和其他樣品相比差別不大，這表明C反應(yīng)器也可能具有潛在的代謝鐵的能力，然而由于反應(yīng)器中未加入Fe或者Fe-Cu，因此這些基因可能并未被表達(dá).

圖6 COG功能分類Fig.6 Functional classification of COG

進(jìn)一步采用KEGG基因數(shù)據(jù)庫對樣品序列進(jìn)行注釋，氮的代謝通路如圖7見第198頁所示，紅色方框表示注釋到的基因，5個樣品中所注釋到的基因相同，表明5個微生物樣品都具有較為完整的氮的代謝通路，注釋到氮的代謝通路的序列比例分別為C 0.21%，F(xiàn)e 0.18%，F(xiàn)e-Cu 0.16%，F(xiàn)e-S 0.31%，F(xiàn)e-Cu-S 0.36%，這個結(jié)果表明Fe和Fe-Cu表面的微生物具有更強(qiáng)的代謝氮的能力.以上結(jié)果也可以看出加入Fe或者Fe-Cu后混合液中的注釋到氮的代謝通路的序列比例均稍低于C反應(yīng)器，因此這個結(jié)果進(jìn)一步表明Fe和Fe-Cu的加入促進(jìn)硝酸鹽的反硝化主要是由于Fe和Fe-Cu表面的微生物作用所致.

圖7 氮代謝途徑Fig.7 Nitrogen metabolism pathway

3 結(jié) 論

1) 采用零價(jià)鐵耦合生物反硝化的工藝，以零價(jià)鐵作為電子供體參與生物反硝化過程，通過提供額外的電子可以提高TN去除效率，實(shí)驗(yàn)中連續(xù)運(yùn)行120 d的Fe-SBR和Cu-Fe-SBR的TN去除率分別穩(wěn)定在30%和20%左右，高于對照SBR反應(yīng)器的12%.

2) 三維熒光分析結(jié)果表明，F(xiàn)e-SBR與Cu-Fe-SBR中的有機(jī)物相較于對照SBR的傳統(tǒng)生物工藝，從結(jié)構(gòu)上有了很大的變化.在有二價(jià)態(tài)金屬存在下，富里酸比腐殖酸更容易被厭氧污泥中的微生物所吸附，其本身又可以充當(dāng)微生物碳源，因此被微生物加以利用，F(xiàn)e-SBR與Cu-Fe-SBR出水中富里酸特征峰均消失，證明Cu2+與Fe2+的存在可能促進(jìn)富里酸的生物吸附.

3) 印染廢水經(jīng)催化臭氧氧化處理后，可生化性得到一定程度的改善，并且反應(yīng)器中存在多種微生物代謝有機(jī)物的途徑.其中，1,1-Dibromo-2-(2,2-dimethylpropyl)cyclopropane、N-Methyl-N-benzyltetra-decanamine等有機(jī)物去除率可達(dá)到100%；大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的去除率也能夠達(dá)到60%以上.

4) 鐵屑或者Fe/Cu雙金屬的加入會改變混合液中微生物群落結(jié)構(gòu)，且Fe和Fe-Cu對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響并不相同.此外，Proteobacteria在鐵屑和催化鐵表面得到了富集(80%左右)，這明顯高于其他樣品(<60%)，這可能與其表面形成生物膜有關(guān)；KEGG分析表明，F(xiàn)e和Fe-Cu表面的微生物對應(yīng)與氮代謝相關(guān)基因的序列豐度更高.