陳 強,呂巍巍,焦 陽,黃銀盈,袁 泉,黃偉偉,孫小琳,周文宗,趙云龍

(1.華東師范大學 生命科學學院，上海 200241； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學院 生態(tài)環(huán)境研究所，上海 201403)

黃鱔(Monopterusalbus)屬輻鰭魚綱(Actinopterygii)、合鰓目(Synbranchiformes)、合鰓魚科(Synbranchidae)、黃鱔屬(Monopterus)，在東南亞到東亞各國均有分布.黃鱔肉質(zhì)鮮嫩，味道鮮美，是人們經(jīng)常食用的淡水魚類之一.隨著黃鱔的消費市場擴大，黃鱔的人工養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增加，但人工養(yǎng)殖的問題也日益顯現(xiàn)，作為種源黃鱔的遺傳多樣性的降低導致后代環(huán)境適應能力下降[1]，同時人工養(yǎng)殖群體也會逃逸到自然環(huán)境中，使野外群體的環(huán)境適應性降低[2-3].因此，加強種源建設，特別是優(yōu)質(zhì)種源的選育或研究十分必要.

亞硝酸鹽是一種廣泛存在于自然界水體中的含氮化合物，由需氧細菌和硝化過程有關的氨形成.在水體中，亞硝酸鹽是對水生動物有害的物質(zhì)之一.隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，高密度大規(guī)模集約化養(yǎng)殖模式的興起，由循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝化細菌活性的不平衡導致的水體中殘余的餌料和高含氮排泄物濃度過高會造成養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度過高，有的可以達到50 mg/L以上[4].而自然水體中，某些水體的亞硝酸鹽濃度也可以達到0.5 mg/L[5]，在一些跨越農(nóng)業(yè)區(qū)域的夏季地表水體中，亞硝酸鹽濃度高達1 mg/L以上[6].亞硝酸鹽水平升高是觸發(fā)壓力反應的潛在因素，甚至可能對水生生物的生存構成重大威脅.

當暴露在一定濃度的亞硝酸鹽環(huán)境中，水生動物生理狀態(tài)會出現(xiàn)多方面的變化.有研究表明高濃度的亞硝酸鹽會抑制免疫功能并改變免疫相關的酶活性[7]，導致氧化應激，氧化應激是亞硝酸鹽的毒性機制之一[8].通常情況下生物體有一套完善的調(diào)節(jié)機制，通過抗氧化酶系統(tǒng)可防止氧化應激.在正常的生理狀態(tài)下，活性氧(ROS)被超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等快速消除[9].同時，氧化應激也可能與炎癥反應的激活有關.炎癥是免疫反應的重要組成部分，主要是由細胞因子介導的[10].響應亞硝酸鹽的促炎細胞因子水平升高，可能反映了亞硝酸鈉增強細胞過氧化損傷的能力.在壓力條件下，熱激蛋白(HSP)充當分子伴侶來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，防止蛋白質(zhì)聚集并協(xié)助錯誤折疊的蛋白重新折疊.據(jù)報道，熱休克蛋白的表達是由環(huán)境壓力誘導的，包括熱應激[11]、病原體感染[12]、重金屬暴露[13]和亞硝酸鹽暴露[9].黃鱔作為形態(tài)特異化的淡水魚類，鰓退化后僅靠皮膚、腸等進行呼吸作用，高密度養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽對其的影響目前尚不清楚.

本文報道不同地方種群的黃鱔在暴露于亞硝酸鹽水體中體內(nèi)非特異性免疫能力與抗氧化能力的變化，檢測了肌肉中生肌調(diào)節(jié)因子相關的基因表達，以此來評估不同地方種群的黃鱔在應對亞硝酸鹽的適應能力，為人工選育抗壓性強的黃鱔品系提供基礎資料.

1 材料與方法

1.1 實驗動物養(yǎng)殖

從中國五大湖即鄱陽湖(PYH)、洞庭湖(DTH)、洪澤湖(HZH)、太湖(TH)和巢湖(CH)使用地籠和鱔籠進行捕捉，傍晚將其放入湖邊水草茂盛處，第2天早上將捕捉到的黃鱔放入暫養(yǎng)箱，使用充氣泵進行持續(xù)供氧，每個群體捕捉到50條后，通過汽車將活體運輸?shù)饺A東師范大學生物站進行為期2周的馴養(yǎng).實驗開始時，各個群體選擇規(guī)格接近，平均體重約為(15.57±1.56)g的個體，每個群體有4個平行塑料缸，每個塑料缸內(nèi)隨機放入9條黃鱔，使用黑色塑料袋和小型鱔巢作為遮蔽物.

在自然水體中亞硝酸鹽的濃度往往可達到1 mg/L左右[14]，因此本文選擇使用1 mg/L 的亞硝酸鹽濃度進行21天暴露.養(yǎng)殖用水為除氯曝氣3天以上的自來水，每個塑料缸加入20 L配置好的1 mg/L的亞硝酸鈉溶液.每天傍晚6點飽食投喂，食物為蚯蚓與商業(yè)飼料的混合物，于第2天早上8點清除殘餌和死亡個體，并重新補足配置好的1 mg/L亞硝酸鈉溶液.在21天的養(yǎng)殖期間持續(xù)充氧，溶解氧濃度大于6.5 mg/L，水溫維持在(27±1)℃，pH 7.0±0.3.

1.2 樣品采集

每7天取樣一次，每組隨機取3條黃鱔.取樣前饑餓處理24 h，用MS-222麻醉.使用2.5 mL一次性塑料針頭抽取1 mL血淋巴，加入1 mL抗凝劑，4 ℃低溫高速離心機3 800 r/min轉(zhuǎn)下離心15 min，分離血漿與血細胞，放入-80 ℃超低溫冰箱儲存待測.將黃鱔置于冰浴中，用無菌鑷子和剪刀完整剪出肝和肌肉，將組織置于離心管中，液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱.

1.3 生化分析

測定肝組織中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)等氧化還原酶和氧化應激指標，采用蘇州科銘相關試劑盒進行測定.樣品可溶性蛋白濃度采用考馬斯亮藍法(蘇州科銘)進行測定.

1.4 基因表達

使用高通量組織研磨儀將第21天的肝和肌肉組織磨碎成懸液，使用TRIzol試劑提取總RNA，用凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，并用NanoDrop分光光度計測量總RNA濃度和OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0最佳.使用帶有去基因組成分的NovoScript 1stStrand cDNA Synthesis試劑盒(Novoprotein)合成cDNA.使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒進行定量PCR反應，定量PCR檢測平臺為BIO-RAD CFX96TM實時系統(tǒng).基因特異性引物如表1所示，使用RPL17作為內(nèi)參基因.

表1 qPCR過程中使用的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤差，使用單因素方差分析(ANOVA)，進行Duncan’s檢驗評估顯著關系,差異顯著表示為P<0.05.整個實驗以年產(chǎn)量最高的江西省鄱陽湖(PYH)群體為對照組.

2 結 果

2.1 亞硝酸鹽對黃鱔抗氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 對肝臟組織抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的影響

肝臟中抗氧化酶酶活和抗氧化物質(zhì)含量如圖1所示.在暴露7 d后，PYH群體的SOD活性顯著高于其他群體(P<0.05)，而在暴露21 d后，各群體間無顯著差異(P>0.05).各群體的CAT活性除暴露14 d后的HZH群體外，其余群體在整個暴露實驗中都無顯著差異(P>0.05).PYH、CH和TH群體的GSH含量表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢.PYH、CH群體的GSSG含量表現(xiàn)出隨時間的增加而持續(xù)下降，TH和DTH群體表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，HZH群體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢.

圖1 在暴露21天過程中各野生黃鱔群體肝臟中抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)含量Fig.1 Antioxidant enzyme activity and antioxidant substance content in the liver of each wild rice eel population during 21 days of exposure

2.1.2 對肝臟組織氧化應激標志含量的影響

組織氧化應激標志LPO和MDA水平變化如圖2所示.PYH群體的LPO呈時間依賴性下降，CH、TH、DTH群體呈先下降后上升的趨勢，在暴露21 d后，PYH群體的LPO含量顯著低于其他群體(P<0.05).PYH群體的MDA含量也呈時間依賴性下降，在暴露7 d和14 d時，除PYH群體外，其他群體間無顯著差異(P>0.05)，在暴露21 d后，各群體間無顯著差異(P>0.05).

圖2 在暴露21天過程中各野生黃鱔群體肝臟中氧化應激標志的含量Fig.2 The content of oxidative stress markers in the liver of each wild rice eel population during 21 days after exposure

2.2 亞硝酸鹽對黃鱔肝臟組織免疫相關基因表達的影響

在暴露21 d后，特異性免疫能力相關基因MHC-2A和非特異性免疫能力抗菌肽相關基因Hepcidin在肝組織中表達結果如圖3所示.與PYH相比，其他群體MHC-2A表達量顯著下降(P<0.05)，而且除TH與HZH之間無顯著差異外(P>0.05)，各群體間存在顯著差異(P<0.05).Hepcidin的表達中，僅TH群體顯著高于PYH群體(P<0.05)，其余群體均顯著低于PYH群體(P<0.05).綜合來看，PYH群體和DTH群體的非特異性免疫能力在暴露于亞硝酸鹽后仍維持較高水平.

圖3 暴露21天后各野生黃鱔群體肝臟中免疫相關基因表達Fig.3 Expression of immune-related genes in the liver of each wild rice eel population after 21 days exposure

2.3 亞硝酸鹽對黃鱔肝臟組織炎癥相關基因表達的影響

在暴露21 d后，肝臟組織中炎癥相關的基因表達結果如圖4所示.與PYH群體相比，DTH群體的COX-1、5-PO和HSP的表達都顯著上升(P<0.05)，而DTH群體的COX-2表達與PYH群體無顯著差異(P>0.05).CH除COX-2顯著下降外(P<0.05)，其余基因表達與PYH群體無顯著差異(P>0.05).TH的COX-2和5-PO的表達均顯著高于PYH(P<0.05)，HSP與COX-1則顯著低于PYH(P<0.05).HZH與PYH相比，COX-1無顯著差異(P>0.05)，其余基因表達則顯著下降(P<0.05).

圖4 暴露21天后各野生黃鱔群體肝臟中炎癥相關基因的表達Fig.4 Expression of inflammation-related genes in the liver of each wild rice eel population after 21 days exposure

2.4 亞硝酸鹽對黃鱔肌肉生肌調(diào)節(jié)因子相關基因表達的影響

各群體肌肉中的生肌調(diào)節(jié)因子相關基因的表達結果如圖5所示.MYF5與MYOD1具有相似的變化趨勢，即CH、TH和HZH群體顯著高于PYH群體(P<0.05)，DTH群體與PYH群體在MYF5的表達上無顯著差異(P>0.05)，但在MYOD1表達時DTH群體顯著高于PYH群體(P<0.05).MRF4和MYOG的變化趨勢也較為一致，CH、TH、DTH和HZH群體都顯著高于PYH群體(P<0.05)，而各群體間的表達也存在差異(P<0.05).

圖5 暴露21天后各野生黃鱔群體肌肉中生肌調(diào)節(jié)因子相關的基因表達Fig.5 Gene expression of myogenic regulatory factors in the muscles of wild rice field eel populations after 21 days exposure

3 討 論

3.1 不同地方種群黃鱔免疫能力的比較

環(huán)境因子使魚類的免疫能力發(fā)生變化已經(jīng)被證明[17]，而亞硝酸鹽水平升高是觸發(fā)脅迫反應的潛在因素，可能對水生生物的生存構成重大威脅.Hepcidin是一種在肝臟合成的抗菌多肽[18]，在水生動物非特異性免疫中起重要作用，能夠直接抑制病原微生物.主要組織相容性復合體MHC-2A屬于體液免疫中的重要分子，在魚類激活機體免疫應答中具有重要作用[19].本文的結果表明在亞硝酸鹽暴露后，非特異性免疫相關基因Hepcidin和體液免疫相關基因MHC-2A在變化上基本一致，而PYH群體和DTH群體的免疫能力相對更高，在逆環(huán)境中能夠更好地抵抗病原微生物的侵襲.亞硝酸鹽濃度的變化會導致水生動物的免疫功能發(fā)生變化，這表明水生動物具有一定的低濃度亞硝酸鹽適應能力，但高濃度會導致免疫損傷[20].本文結果證明不同地理群體的黃鱔在免疫能力上具有差異性，與在中華鱉、紅鯉和團頭魴中的研究發(fā)現(xiàn)一致[21-23].

在眾多炎癥介質(zhì)中，COX和5-LO被認為是參與炎癥反應的重要分子，而HSP在氧化應激和炎癥中被誘導產(chǎn)生并維護細胞的正常功能.本文的結果中COX與5-PO表達的升高表明機體可能面臨較為嚴重的炎癥反應，而HSP在各群體中則與前兩者變化較為一致，因為HSP是一個對亞硝酸鹽脅迫敏感的基因，會參與應對炎癥反應并調(diào)節(jié)適應性反應[24].這在相關的文獻中已證實，亞硝酸鹽暴露后破壞魚的抗氧化系統(tǒng)會誘導HSP表達，同時缺氧應激會上調(diào)動物組織中的HSP水平[25].所以HSP的表達是炎癥與亞硝酸鹽共同導致的結果.綜合來看，TH和DTH群體可能面臨更為嚴重的炎癥反應，而PYH、CH和HZH群體則面臨較輕微的炎癥反應.

3.2 不同地方種群黃鱔抗氧化能力的比較

由于長期暴露于環(huán)境污染物，水生生物通常會遭受持續(xù)的氧化應激.SOD是一種特異性清除超氧化物自由基并生成H2O2的胞質(zhì)酶.在本研究中，應對1 mg/L的亞硝酸鈉的暴露時，黃鱔體內(nèi)的氧化應激體系能夠正常工作，但隨著暴露時間的延長，SOD酶的活性下降，表明H2O2形成可能減少，也可能是SOD酶活性被環(huán)境中的亞硝酸鹽抑制[26].CAT是主要的抗氧化系統(tǒng)成分，主要起到催化H2O2分解為H2O，能緩解源自SOD活性的H2O2中毒.肝臟中的CAT活性與SOD活性變化一致，是因為相比于SOD在氧化應激前期開始起作用，CAT具有滯后性，主要在在亞硝酸鹽脅迫的后期發(fā)揮作用[9].GSH與GSSG是細胞內(nèi)最重要的氧化還原對之一，對于清除細胞中的自由基具有重要作用.魚類體內(nèi)主要由谷胱甘肽還原酶調(diào)控GSSG轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH，但在亞硝酸鹽脅迫下，谷胱甘肽還原酶表達和活性會顯著升高以響應氧化應激[27].在正常情況下，GSH濃度高于GSSG，但當遭遇過量氧化應激狀態(tài)時，GSSG濃度會高于GSH[27].本文的結果也表明肝臟GSSG濃度都高于GSH濃度，進一步證明了各群體黃鱔處于氧化應激狀態(tài).

LPO是氧化應激條件下導致細胞功能喪失的主要因子，可能導致脂質(zhì)膜完整性的喪失和有毒醛的產(chǎn)生.丙二醛(MDA)是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一，被廣泛用作脂質(zhì)過氧化的標志物，其升高的水平可以反映肝臟對脂質(zhì)過氧化損傷的程度,這兩種物質(zhì)可以清楚地反映組織受氧化應激損害的程度.亞硝酸鹽會誘導體內(nèi)的ROS過量產(chǎn)生[8]，從而破壞抗氧化系統(tǒng)的正常功能，結果表明LPO與MDA含量在暴露7 d和14 d時，各群體具有一致性的變化趨勢，表明抗氧化系統(tǒng)在黃鱔體內(nèi)的維持，但在21 d時逐漸下降，表明亞硝酸鹽誘導ROS過量產(chǎn)生后，抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)逐漸修復體內(nèi)的氧化損傷，這也提示黃鱔可以較好地適應1 mg/L的亞硝酸鹽壓力.綜合抗氧化系統(tǒng)表現(xiàn)與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物含量評估，可以發(fā)現(xiàn)在早期暴露中PYH群體和CH群體在抗氧化能力上較強.

3.3 不同地方種群黃鱔肌肉分化生長能力的比較

黃鱔生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族包括MYF5、MYOD1、MYOD2、MYOG和MRF4，在肌肉細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮關鍵作用.魚類生肌調(diào)節(jié)因子可以分為兩大類，第一大類(MYF5和MYOD)為生肌決定因子，促使肌肉前體細胞分化成肌細胞；第二大類(MYOG和MRF4)為生肌調(diào)節(jié)因子，主要促進成肌細胞轉(zhuǎn)向終末骨骼肌肌纖維[28].在黃鱔體重14～27 g的階段，MYF5和MYOD1高表達，而MRF4和MYOG較為穩(wěn)定地低表達[29].這與本文選用(15.57±1.56) g的幼鱔結果較為一致，表明在幼魚成長為成魚的過程中，以肌纖維的增粗為主，主要是由MYOD和MYF5調(diào)控[30].值得注意地是，亞硝酸鹽會增加肌肉前體細胞的增殖和代謝活性[31]，但尚不清楚是否會對黃鱔產(chǎn)生同樣的效果.而在不同的群體當中，發(fā)現(xiàn)PYH群體的肌肉生長調(diào)控相比其他群體顯著不足，而CH群體在面臨環(huán)境壓力時具有更好的肌肉生長分化能力.

本文利用同一濃度的亞硝酸鈉暴露不同地方群體的黃鱔，通過檢測肝臟免疫能力和炎癥因子的基因表達水平，肝臟抗氧化系統(tǒng)中的相關指標和肌肉調(diào)節(jié)因子的水平，發(fā)現(xiàn)不同地方種群的黃鱔在面對亞硝酸鹽暴露時，PYH群體和DTH群體的免疫能力相對較高，在逆環(huán)境中能夠更好的抵抗病原微生物的侵襲；PYH、CH和HZH群體則具有較低的炎癥反應；在早期暴露中PYH群體和CH群體在抗氧化能力上較強；CH群體相對在面臨環(huán)境壓力時具有更好的肌肉生長分化能力.本文證明了不同地理群體的黃鱔在面對同一環(huán)境時生理功能存在差異，可為黃鱔的人工選育提供基礎資料.