婁方練，鄭周海，付福建

(重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院骨科，重慶 408400)

>50%的慢性和惡性感染由革蘭陽(yáng)性葡萄球菌引起，其中以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌最為常見(jiàn)[1]。在美國(guó)和歐洲，引起假體關(guān)節(jié)感染的凝固酶陰性葡萄球菌中，>80%的菌株對(duì)甲氧西林耐藥；慢性細(xì)菌的感染過(guò)程中常涉及生物膜的形成[2-3]，并且生物膜內(nèi)微環(huán)境的改變會(huì)影響藥物的抗菌作用，因此，臨床上由耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusepidermidis, MRSE)引起的植入物相關(guān)感染治療困難，抗菌藥物療效局限，通常需要移除所有的假體或充分清創(chuàng)才能得以痊愈[4-5]。針對(duì)MRSE相關(guān)性植入物導(dǎo)致的骨髓炎需要安全有效的抗菌方案。

目前，萬(wàn)古霉素是MRSE感染的首選治療藥物，但由于針對(duì)MRSE的萬(wàn)古霉素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)相對(duì)較高，一些研究結(jié)果認(rèn)為對(duì)于MRSE，萬(wàn)古霉素具有潛在毒性和有限的殺菌作用[6-7]。利福平在生物膜相關(guān)感染中的治療效果明顯，但針對(duì)耐藥菌的治療仍具有風(fēng)險(xiǎn)，因此不作為單一藥物進(jìn)行使用。特地唑胺是噁唑烷酮類(lèi)抗菌藥物，經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于急性細(xì)菌性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染的治療，并且其對(duì)耐甲氧西林葡萄球菌具有更強(qiáng)的作用[8-9]。但目前尚無(wú)針對(duì)特地唑胺治療MRSE植入物相關(guān)性骨髓炎的具體研究，因此，本研究利用MRSE菌株建立了骨髓炎大鼠模型，將特地唑胺單藥、特地唑胺聯(lián)合利福平、利福平單藥、萬(wàn)古霉素單藥以及萬(wàn)古霉素聯(lián)合利福平的治療效果進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

RM2235型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片(Leica公司)；BX41型光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)；DS-Ril型生物數(shù)碼顯微鏡(Nikon公司)。

1.2 MRSE菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

MRSE菌株：研究所涉及到的MRSE菌株最初是從恢復(fù)期的假體周?chē)腥净颊攉@取。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性大鼠94只，體重250～350 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002。本研究相關(guān)內(nèi)容獲得了醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 藥品與試劑

注射用鹽酸萬(wàn)古霉素(批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20084268，規(guī)格為0.5 g)購(gòu)自重慶萊美藥業(yè)股份有限公司；注射用磷酸特地唑胺(CAS號(hào):856867-55-5)購(gòu)自美國(guó)Merck公司；利福平注射液[批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20050725，規(guī)格為5 ml∶ 0.3 g(以利福平計(jì))]購(gòu)自沈陽(yáng)雙鼎制藥有限公司。0.9%氯化鈉溶液購(gòu)自廣州珠江制藥廠。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

采用體重250～350 g的雄性大鼠94只建立實(shí)驗(yàn)性植入物相關(guān)性骨髓炎模型。首先，腹腔注射氯胺酮(60 mg/kg)和甲苯噻嗪(6 mg/kg)進(jìn)行全身麻醉之后，剃光大鼠左腿毛發(fā)，手術(shù)暴露左腿脛骨近端1/3，髓腔內(nèi)鉆取1.5 mm直徑孔。在0.9%氯化鈉溶液中加入硬化劑、花生四烯酸鈉鹽并注入髓腔。將108CFU/ml MRSE懸液100 μl注射至骨髓中。預(yù)先準(zhǔn)備直徑5 mm、長(zhǎng)度1 mm的不銹鋼絲，浸泡于MRSE和色氨酸酶大豆肉湯混合的懸浮液1 ml中，37 ℃環(huán)境下孵育2 h，使其形成生物膜，并將帶有生物膜的金屬絲植入骨髓腔內(nèi)。以石膏覆蓋孔口，用縫合線(xiàn)縫合筋膜和皮膚，并在傷口上噴灑殺菌劑。皮下注射緩釋丁丙諾啡(0.05 mg/kg)止痛。為驗(yàn)證模型是否成功，于感染1周后取5只大鼠進(jìn)行定量骨和鋼絲的細(xì)菌培養(yǎng)。

2.2 分組

確定感染后，94只動(dòng)物開(kāi)始接受不同的藥物治療。動(dòng)物隨機(jī)分為6組：對(duì)照組(18例)、特地唑胺治療組(16例)、特地唑胺-利福平聯(lián)合治療組(15例)、利福平治療組(15例)、萬(wàn)古霉素治療組(15例)以及萬(wàn)古霉素-利福平聯(lián)合治療組(15例)。選擇合適的劑量模擬上述人體MIC濃度。不同藥物的給藥劑量和方法如下：特地唑胺30 mg/kg，1日1次；利福平25 mg/kg，1日2次；萬(wàn)古霉素50 mg/kg，1日2次；上述藥物均為腹腔注射，連續(xù)治療14 d。

治療結(jié)束后24 h處死大鼠。無(wú)菌條件下取出左側(cè)脛骨，如果需要培養(yǎng)，則冷凍于-80 ℃環(huán)境中。每組取1只大鼠脛骨進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。在植入鋼絲的5 mm范圍內(nèi)切割和粉碎骨頭、稱(chēng)重，并對(duì)不銹鋼絲進(jìn)行無(wú)菌處理。將粉碎的骨頭和鋼絲分別懸浮于胰蛋白胨大豆肉湯2 ml中，渦旋30 s，40 kHz下超聲5 min。進(jìn)行定量骨和鋼絲細(xì)菌培養(yǎng)。如果在定量培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，則在剩余的2 ml肉湯中加入無(wú)菌胰蛋白胨大豆肉湯8 ml，37 ℃下孵育48 h，進(jìn)行定性培養(yǎng)。對(duì)于有生長(zhǎng)跡象的肉湯，進(jìn)行傳代，以確定存在MRSE。

2.3 抗菌藥物的MIC測(cè)定

對(duì)于治療后從骨或鋼絲上恢復(fù)的MRSE，使用定量培養(yǎng)板上的3個(gè)菌落測(cè)定特地唑胺、利福平或萬(wàn)古霉素的MIC。采用瓊脂稀釋法測(cè)定生物膜測(cè)定最低生物膜抑菌濃度(MBIC)和最低生物膜殺菌濃度(MBBC)，具體方法如下：將不同濃度劑量的抗菌藥物稀釋后加入融化并冷卻至約50 ℃的瓊脂中，制成不同藥物濃度梯度的平板并接種獲取的MRSE菌種，孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，測(cè)定MBIC和MBBC。

2.4 組織病理學(xué)檢查

每組隨機(jī)抽取1只大鼠取下的脛骨，在10%甲醛中固定2 d，在5%硝酸溶液中脫鈣。脛骨縱切成兩半，石蠟包埋，頂部有髓腔表面，縱切，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。觀察成骨細(xì)胞數(shù)量，骨重建形成和骨破壞情況，以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以骨(g)或鋼絲(cm2)表面葡萄球菌數(shù)目(以lg CFU表示)的中位數(shù)和四分位數(shù)間距(IQR)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述；使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較各組細(xì)菌數(shù)量差異，進(jìn)一步采用威爾科克森秩和檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組與5個(gè)治療組的組間比較；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各藥的MIC、MBIC以及MBBC

各藥針對(duì)MRSE的MIC：萬(wàn)古霉素為2 μg/ml，利福平≤0.015 μg/ml，特地唑胺為0.5 μg/ml。各藥針對(duì)MRSE的MBIC：萬(wàn)古霉素為2 μg/ml，利福平為0.001 μg/ml，特地唑胺為2 μg/ml。各藥針對(duì)MRSE的MBBC：萬(wàn)古霉素為128 μg/ml，利福平為2 μg/ml，特地唑胺為32 μg/ml。

3.2 實(shí)驗(yàn)性骨髓炎大鼠模型的構(gòu)建及藥物治療效果評(píng)估

建模1周后檢測(cè)大鼠骨組織中MRES的細(xì)菌數(shù)量，中位細(xì)菌數(shù)量為4.89 lg CFU/g[IQR為(3.83～5.33)lg CFU/g]，并且所有鋼絲表面均檢測(cè)到MRSE。經(jīng)藥物治療后再次對(duì)骨組織進(jìn)行細(xì)菌的定量培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1(A)。對(duì)照組的MRSE細(xì)菌數(shù)量為3.70 lg CFU/g [IQR為(0.5～4.29)lg CFU/g]，特地唑胺組為0.50 lg CFU/g[IQR為(0.1～2.68)lg CFU/g]，萬(wàn)古霉素組為2.78 lg CFU/g [IQR為(0.50～3.64)lg CFU/g]。利福平治療組、特地唑胺-利福平聯(lián)合治療組及萬(wàn)古霉素-利福平聯(lián)合治療組的骨組織中均未檢出MRSE。除萬(wàn)古霉素治療組外，其他治療組的菌落計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.005)。特地唑胺治療組與萬(wàn)古霉素治療組比較，殘留細(xì)菌數(shù)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)。但特地唑胺治療組與利福平治療組(P=0.000 8)、萬(wàn)古霉素治療組與利福平治療組(P=0.000 3)的細(xì)菌數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

同時(shí)，對(duì)鋼絲上的MRSE進(jìn)行定量培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1(B)。利福平治療組(P=0.02)、特地唑胺治療組(P=0.43)、特地唑胺-利福平聯(lián)合治療組(P=0.003)及萬(wàn)古霉素-利福平聯(lián)合治療組(P=0.003)的MRSE菌落數(shù)與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但萬(wàn)古霉素治療組MRSE菌落數(shù)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.27)。

A.MRSE細(xì)菌的骨組織定量培養(yǎng)結(jié)果(以每克骨組織的細(xì)菌菌落數(shù)lg CFU表示)；B.MRSE細(xì)菌的鋼絲定量培養(yǎng)結(jié)果(以每cm2表面積中的細(xì)菌菌落數(shù)lg CFU表示)；*P<0.005；水平線(xiàn)表示中位數(shù)A.quantitative culture results on bone tissue of MRSE bacteria (expressed as lg CFU of bacterial colonies per gram of bone tissue；B.quantitative culture results on steel wire of MRSE bacteria (expressed as lg CFU of bacterial colonies per cm2 of surface area)；*P<0.005; the horizontal line indicates the median圖1 骨組織及鋼絲表面細(xì)菌的定量培養(yǎng)結(jié)果Fig 1 Quantitative culture results on bone tissue and steel wire surface of bacteria

3.3 骨組織的病理學(xué)分析

對(duì)骨組織進(jìn)行HE染色，由圖2可知，在MRSE細(xì)菌的刺激下，對(duì)照組中的成骨細(xì)胞活性顯著增加，骨重建明顯[圖2(A)箭頭所示]，但大鼠的骨組織標(biāo)本中均無(wú)急性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的跡象；在萬(wàn)古霉素治療組大鼠的骨骼橫截面上的髓腔內(nèi)可見(jiàn)一條鋼絲穿透切跡[圖2(B)箭頭所示]。

A.對(duì)照組(HE染色，×400倍)；B.萬(wàn)古霉素治療組(×20倍)A.control group(HE staining, ×400 times); B.vancomycin treatment group(×20 times)圖2 骨組織病理學(xué)圖像Fig 2 Histopathological analysis of bone tissue

4 討論

本研究采用假體周?chē)腥净颊邅?lái)源的MRSE菌株構(gòu)建骨髓炎大鼠模型，進(jìn)行特地唑胺、利福平以及萬(wàn)古霉素的藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)除單用萬(wàn)古霉素效果不佳外，特地唑胺聯(lián)合利福平、萬(wàn)古霉素聯(lián)合利福平均對(duì)MRSE感染的骨髓炎動(dòng)物模型具有較好的治療效果。

雖然在感染性心內(nèi)膜炎以及小鼠導(dǎo)管相關(guān)生物膜感染模型中，特地唑胺對(duì)MRSA的治療作用已經(jīng)得到了驗(yàn)證[10-11]，但特地唑胺針對(duì)MRSE在骨髓炎中的作用尚未得到研究結(jié)果證明。本研究成功建立了一種實(shí)驗(yàn)性植入物相關(guān)性骨髓炎大鼠模型，并將其用于評(píng)價(jià)特地唑胺對(duì)MRSE的治療作用。既往有研究報(bào)道認(rèn)為，可以通過(guò)將細(xì)菌直接注入髓腔4周后產(chǎn)生骨髓感染，建立骨髓炎模型[12-14]。但是，單純注射MRSE并不能產(chǎn)生足夠的感染力，機(jī)體能夠通過(guò)自身的免疫反應(yīng)在3周內(nèi)清除病原，因此，骨髓炎建模的成功率不穩(wěn)定。本研究對(duì)既往MSRA骨髓炎模型進(jìn)行了改進(jìn)，包括篩選來(lái)自臨床患者的常見(jiàn)菌株，借助鋼絲形成MRSE的生物膜并轉(zhuǎn)移至骨髓腔內(nèi)，使模型更符合臨床常見(jiàn)的植入物源性骨髓炎的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，將感染時(shí)間和治療間隔分別縮短至1周和2周，避免了因疾病自限性造成的假陽(yáng)性。此外，本研究觀察到MRSE的數(shù)量隨著時(shí)間的推移而減少(1周時(shí)為4.89 lg CFU/g，3周時(shí)為3.7 lg CFU/g)；發(fā)現(xiàn)感染3周后骨組織病理切片沒(méi)有急性炎癥的跡象，但會(huì)出現(xiàn)骨重塑和成骨活性的增加。這與既往的研究結(jié)果一致，金屬植入物的大鼠股骨骨折模型的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)中輕度表皮葡萄球菌污染不會(huì)出現(xiàn)明顯的感染癥狀，但是會(huì)抑制骨愈合[15-16]。

本研究觀察到萬(wàn)古霉素單藥治療并不能減少細(xì)菌數(shù)量，而特地唑胺單藥治療可以明顯抑制細(xì)菌數(shù)量，MRSE在骨內(nèi)、鋼絲上的中位數(shù)均低于萬(wàn)古霉素單藥治療組。特地唑胺-利福平聯(lián)合治療組的MRSE數(shù)量較無(wú)治療組明顯減少，且特地唑胺-利福平聯(lián)合治療與萬(wàn)古霉素-利福平聯(lián)合治療效果相當(dāng)。雖然臨床上針對(duì)MRSE的治療通常會(huì)選擇萬(wàn)古霉素，但葡萄球菌可能存在一定的耐藥性[17]，因此一直存在爭(zhēng)議。最近，相關(guān)研究報(bào)道，在小鼠皮下導(dǎo)管相關(guān)生物膜感染模型中，特地唑胺降低MRSA密度的效果優(yōu)于利奈唑胺和萬(wàn)古霉素[18]。特地唑胺對(duì)葡萄球菌的體外藥效是萬(wàn)古霉素的2～8倍[19]，其對(duì)葡萄球菌的抑菌作用和抗生素后效應(yīng)優(yōu)于利奈唑胺。特地唑胺孵育6～24 h內(nèi)可明顯阻止細(xì)菌再生，而根據(jù)體內(nèi)生物熒光成像檢測(cè)證實(shí)特地唑胺與停藥后復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)[20]。目前的研究結(jié)果表明，特地唑胺聯(lián)合利福平治療可能是MRSE植入物相關(guān)性骨髓炎的一種具有臨床應(yīng)用前景的治療方案。

本研究也具有一定的局限性。首先，使用了單一的菌株。其次，由于感染持續(xù)時(shí)間短，該模型可能不能反映慢性骨髓炎的治療效果。綜上所述，本研究建立了一種新的大鼠MRSE骨髓炎模型，該模型可用于研究抗菌治療方案的效果，并且本研究成功證實(shí)特地唑胺與利福平聯(lián)合治療對(duì)MRSE外源性骨髓炎具備較好的治療效果。