馬建文，馮 偉

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830000； 2.烏魯木齊市婦幼保健院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830000)

何首烏有生何首烏和制何首烏之分。生何首烏具有解毒、潤(rùn)腸通便和消癰等功效[1]。制何首烏具有清熱解毒、補(bǔ)血養(yǎng)腎等功效[2]。研究結(jié)果表明，黑豆可增強(qiáng)和改變生何首烏的療效[3]。目前，何首烏炮制時(shí)間與制何首烏質(zhì)量檢測(cè)尚未有明確規(guī)定，導(dǎo)致市場(chǎng)流通的制何首烏大多未按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炮制或添加人工色素以達(dá)到外觀要求，內(nèi)在質(zhì)量懸殊[4]。黑豆汁制何首烏與清蒸何首烏僅從外觀性狀上難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，多通過檢測(cè)二苯乙烯苷類和蒽醌類化合物的含量鑒別其質(zhì)量[5]。二苯乙烯苷類和蒽醌類化合物在何首烏炮制過程中含量不穩(wěn)定，易揮發(fā)或分解[6]。近年來，有研究在黑豆汁制何首烏中檢測(cè)出了大豆苷元[7]。本研究探討了大豆苷元在鑒別不同何首烏炮制品中的應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

XS101型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，精度0.01 mg/0.1 mg)；DHG-9 240 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮機(jī)械有限公司)；硅膠板G高效板(青島海洋化工廠分廠)；1220型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 藥品與試劑

生何首烏購于湖北道地藥材科技有限公司；大豆苷元購自中國藥品生物制品鑒定所，批號(hào)為111502-200402；黑豆、二苯乙烯苷、大黃素及大黃素甲醚購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為120975-201707、110844-201109、110756-200110及110758-20101。

2 方法

2.1 何首烏的制備

由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑科制備。(1)生何首烏：電子天平稱取生何首烏100.00 g，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥處理，研磨備用。(2)清蒸何首烏：電子天平稱取生何首烏100.00 g，置于陶瓷容器內(nèi)坐水鍋中隔水燉制24 h，取出置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥處理，研磨備用。(3)黑豆汁制何首烏：參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行炮制，電子天平稱取黑豆1 000.00 g，置于鍋內(nèi)加水煎煮4 h；濾網(wǎng)過濾取濾液，剩余豆渣加純凈水5 000.00 g煎煮3 h；濾網(wǎng)過濾取濾液，合并2次濾液，稱取生何首烏400.00 g攪拌均勻，置于陶瓷容器內(nèi)坐水鍋中隔水燉制24 h，取出置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥處理，研磨備用。

2.2 溶液的制備

(1)供試品溶液：分別取“2.1”項(xiàng)下3種何首烏粉末2 g，加無水乙醇-鹽酸混合溶液(V∶V=4∶ 1)40 ml，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流提取1 h，放冷至室溫(25 ℃)，再稱定質(zhì)量，并用上述無水乙醇-鹽酸混合溶液補(bǔ)足損失的溶劑量，濾過，濾液濃縮至適量，蒸干；殘?jiān)芯芗尤?0 ml水溶解；加入乙酸乙酯溶液(30 ml)萃取3次，每次10 ml，合并3次萃取液；萃取液濃縮至10 ml，加在聚酚(酰)胺柱上，以50 ml水洗脫，棄去水洗脫液；再以50 ml乙醇洗脫，收集洗脫液；洗脫液濃縮至適量，蒸干，殘?jiān)屑尤爰状既芤? ml使溶解，即可。(2)對(duì)照品溶液：分別取大豆苷元、黑豆、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚加入甲醇混勻后制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3 薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)分析

吸取供試品溶液4 μl和對(duì)照品溶液2 μl，點(diǎn)于同一硅膠板G高效板(10 cm×10 cm)；將氯仿和無水乙醇以體積比10∶ 1.2混合，滴加至薄層板上作為展開劑，取出晾干，紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.4 高效液相色譜(high performance liquid chromato-graphy，HPLC)分析

采用1220型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈(V∶V∶V=2∶ 6∶ 2)，柱溫為25 ℃，流速為8.0 ml/min，測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm(大豆苷元、大黃素及大黃素甲醚)、320 nm(二苯乙烯苷)，進(jìn)樣量為15 μl。

(1)大豆苷元:吸取對(duì)照品溶液0.1 ml加入流動(dòng)相稀釋至69.6 μg/ml，經(jīng)濾膜(0.45 μm)過濾后進(jìn)行色譜分析；(2)黑豆:吸取對(duì)照品溶液0.2 ml加入流動(dòng)相稀釋至139.4 μg/ml，經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析；(3)二苯乙烯苷:吸取對(duì)照品溶液0.8 ml加入流動(dòng)相稀釋至278.8 μg/ml，經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析；(4)大黃素:吸取對(duì)照品溶液1.6 ml加入流動(dòng)相稀釋至557.6 μg/ml，經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析；(5)大黃素甲醚:吸取對(duì)照品溶液3.2 ml加入流動(dòng)相稀釋至1 115.2 μg/ml，經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液各6份，按照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，觀察并記錄各成分峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RSD≤3.0%提示重復(fù)性好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，于室溫下分別放置0、5、10、20、30和48 h后按照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，觀察并記錄各成分峰面積，計(jì)算RSD，RSD≤2.0%提示穩(wěn)定性好。

2.7 精密度試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液10 μl，按照“2.4”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，觀察并記錄各成分峰面積，計(jì)算RSD，RSD≤2.0%提示精密度好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知成分含量的供試品溶液各6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品后按照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，根據(jù)峰面積計(jì)算含量，得出平均加樣回收率和RSD，RSD≤3.0%提示回收率佳。

3 結(jié)果

3.1 供試品與對(duì)照品TLC分析結(jié)果

黑豆汁制何首烏溶液色譜中在與黑豆對(duì)照品和大豆苷元對(duì)照品相應(yīng)位置上顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)，生何首烏、清蒸何首烏溶液色譜中未顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)，見圖1。

1.生何首烏；2.黑豆汁制何首烏；3.大豆苷元對(duì)照品；4.黑豆對(duì)照品；5.清蒸何首烏1. raw polygonum multiflorum; 2. polygonum multiflorum made from black bean juice; 3. reference substance of isoflavoues aglycone; 4. reference substance of black bean; 5. steamed polygonum multiflorum圖1 何首烏不同炮制品種與對(duì)照品的TLC圖Fig 1 TLC diagrams of reference substance and different processed varieties of polygonum multiflorum

3.2 供試品與對(duì)照品HPLC分析結(jié)果

生何首烏色譜上出現(xiàn)與二苯乙烯苷和大黃素相同特征峰，未出現(xiàn)與大豆苷元、黑豆和大黃素甲醚相同特征峰，見圖2—3；清蒸何首烏色譜上出現(xiàn)與二苯乙烯苷、大黃素及大黃素甲醚相同特征峰，未出現(xiàn)與大豆苷元和黑豆相同特征峰，見圖2、4；黑豆汁制何首烏色譜上出現(xiàn)與大豆苷元、黑豆、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚相同特征峰，見圖2、5。

A.大豆苷元對(duì)照品；B.黑豆對(duì)照品；C.二苯乙烯苷對(duì)照品；D.大黃素對(duì)照品；E.大黃素甲醚對(duì)照品A. reference substance of isoflavoues aglycone; B. reference substance of black bean; C. reference substance of stibene glucoside; D. reference substance of emodin; E. reference substance of physcion圖2 對(duì)照品溶液的HPLC圖Fig 2 HPLC diagram of reference solution

3.3 線性關(guān)系考察結(jié)果

大豆苷元進(jìn)樣量在1.479～18.782 μg范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)色譜峰面積積分值存在線性關(guān)系；二苯乙烯苷進(jìn)樣量在0.942～18.364 μg范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)色譜峰面積積分值存在線性關(guān)系；大黃素進(jìn)樣量在0.235～2.672 μg范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)色譜峰面積積分值存在線性關(guān)系；大黃素甲醚進(jìn)樣量在0.514～5.336 μg范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)色譜峰面積積分值存在線性關(guān)系，見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Inspection results of linear relationship

3.4 何首烏不同炮制品中各成分含量測(cè)定結(jié)果

生何首烏和清蒸何首烏供試品溶液中未檢測(cè)出大豆苷元。黑豆汁制何首烏大豆苷元含量高于生何首烏和清蒸何首烏，二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚含量低于生何首烏和清蒸何首烏，見表2。

表2 何首烏不同炮制品中各成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/g)Tab 2 Determination results of various components in different processed products of polygonum multiflorum(n=3, mg/g)

3.5 重復(fù)性、穩(wěn)定性及精密度考察結(jié)果

大豆苷元、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚重復(fù)性的RSD≤3.0%，穩(wěn)定性的RSD≤2.0%，精密度的RSD≤2.0%，見表3。

表3 重復(fù)性、穩(wěn)定性及精密度考察結(jié)果(%，n=6)Tab 3 Inspection results of repeatability, stability and precision (%, n=6)

3.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

大豆苷元、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚的平均回收率均>95%，見表4。

表4 加樣回收率考察結(jié)果(%，n=6)Tab 4 Inspection results of adding sample recovery (%, n=6)

4 討論

生何首烏味苦澀、色黃白，主要含蒽醌類化合物和二苯乙烯苷[9]。游離蒽醌衍生物可促進(jìn)膽固醇代謝，具有抑制腸道對(duì)膽固醇再吸收的作用[10]；結(jié)合蒽醌可促進(jìn)腸管蠕動(dòng)，具有瀉下作用[11]；二苯乙烯苷衍生物具有降膽固醇和保肝作用[12]。歷代文獻(xiàn)中，制何首烏的臨床應(yīng)用多于生何首烏[13]。近代制何首烏炮制方法有熟地汁蒸、黑豆生姜汁煮等，而黑豆汁制何首烏方法從唐代沿用至今，應(yīng)用歷史長(zhǎng)[14]。HPLC法為目前藥物雜質(zhì)檢查常用手段[15]。以往，多通過HPLC法測(cè)定何首烏中大黃素、大黃素甲醚和二苯乙烯苷含量來檢測(cè)其質(zhì)量[16]。但多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，生何首烏經(jīng)炮制后二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚的含量可減少[17-18]?！吨腥A人民共和國藥典：一部》(2015年版)中指出，大豆苷元為黑豆質(zhì)量控制的主要指標(biāo)成分。鄧青等[7]從黑豆汁制何首烏中檢測(cè)出了大豆苷元。

A.大豆苷元；B.二苯乙烯苷；C.大黃素；D.大黃素甲醚A. isoflavoues aglycone; B. stilbene glucoside; C. emodin; D. physcion圖3 生何首烏溶液的HPLC圖Fig 3 HPLC diagram of raw polygonum multiflorum

A.大豆苷元；B.二苯乙烯苷；C.大黃素；D.大黃素甲醚A. isoflavoues aglycone; B. stilbene glucoside; C. emodin; D. physcion圖4 清蒸何首烏溶液的HPLC圖Fig 4 HPLC diagram of steamed polygonum multiflorum

A.大豆苷元；B.二苯乙烯苷；C.大黃素；D.大黃素甲醚A. isoflavoues aglycone; B. stilbene glucoside; C. emodin; D. physcion圖5 黑豆汁制何首烏溶液的HPLC圖Fig 5 HPLC diagram of polygonum multiflorum made from black bean juice

本研究中TLC分析結(jié)果顯示，黑豆汁制何首烏溶液色譜中在與黑豆對(duì)照品和大豆苷元對(duì)照品相應(yīng)位置上顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)，生何首烏、清蒸何首烏溶液色譜中未顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)，提示經(jīng)黑豆汁炮制后何首烏中存在大豆苷元成分，與鄧青等[7]的研究結(jié)果一致。HPLC分析結(jié)果顯示，各待測(cè)成分出峰情況和分離效果較好，生何首烏色譜上出現(xiàn)與二苯乙烯苷和大黃素相同特征峰，未出現(xiàn)與大豆苷元、黑豆和大黃素甲醚相同特征峰；清蒸何首烏色譜上出現(xiàn)與二苯乙烯苷、大黃素及大黃素甲醚相同特征峰，未出現(xiàn)與大豆苷元和黑豆相同特征峰；黑豆汁制何首烏色譜上出現(xiàn)與大豆苷元、黑豆、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚相同特征峰，提示炮制后何首烏中有效成分有所改變，符合以往研究結(jié)果[19-20]，同時(shí)說明大豆苷元可作為鑒別黑豆汁制何首烏和生首烏、清蒸何首烏的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，大豆苷元、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚進(jìn)樣量在一定范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)色譜峰面積存在線性關(guān)系，提示HPLC法中流動(dòng)相洗脫效果較高，不同極性物質(zhì)保留時(shí)間和峰面積存在差異，有利于對(duì)何首烏中各成分鑒定。通過對(duì)供試品溶液各成分定量分析得出，黑豆汁制何首烏大豆苷元含量高于生何首烏和清蒸何首烏，二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚含量低于生何首烏和清蒸何首烏；生何首烏和清蒸何首烏供試品溶液中未檢測(cè)出大豆苷元，進(jìn)一步證實(shí)大豆苷元含量測(cè)定對(duì)制首烏質(zhì)量控制具有推廣應(yīng)用價(jià)值。本研究中，HPLC法對(duì)檢測(cè)黑豆汁制何首烏中大豆苷元含量具有較好的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度以及可靠性，但實(shí)施過程中需嚴(yán)格控制受試品進(jìn)樣量。

綜上所述，經(jīng)炮制的何首烏中有效成分含量可發(fā)生改變，大豆苷元含量可作為黑豆汁制何首烏與其他炮制工藝何首烏的鑒別與質(zhì)量控制的檢測(cè)指標(biāo)。