邱揚(yáng)，陳龍飛，王曉玉，林紹強(qiáng)

1.江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000； 2.佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528010；3.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630； 4.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630

卵巢癌術(shù)后復(fù)發(fā)及治療失敗的重要原因是癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，罹患卵巢癌接受規(guī)范化治療后仍有62%的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或處于疾病持續(xù)存在狀態(tài)[1]?，F(xiàn)階段，開發(fā)對(duì)耐藥癌株有效的新型藥物仍是卵巢癌治療研究中的熱點(diǎn)。姜黃素是從姜黃、郁金等姜科姜黃屬植物根莖中提取出的一種有效成分，具有多種藥理活性，對(duì)胃腸道、乳腺及泌尿生殖系統(tǒng)等惡性腫瘤均顯示出一定的抑制作用[2-3]。然而，CUR存在水溶解度低、水溶液易水解、首過消除效應(yīng)明顯、生物利用度偏低等不足，阻礙其臨床應(yīng)用[4]。L50H8是一種通過分子結(jié)構(gòu)修飾獲得的CUR類似物，具有更高的穩(wěn)定性與生物利用度。本研究選擇對(duì)順鉑及阿霉素耐藥的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3為模型，評(píng)估L50H8在體外對(duì)癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并對(duì)其機(jī)制作初步探討。

1 材料

1.1 細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗(1×105IU·L-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素)配制成PRMI1640完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑L50H8由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成并純化。RPMIl640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司，批號(hào)：C22400500BT)；胎牛血清(中國杭州四季青公司，批號(hào)：11011-8615)；Annexin V-FICT/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司，批號(hào)：556507)；蛋白定量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司，批號(hào)：KGP902)；MTT和DMSO(德國Sigma公司，批號(hào)：M5655-1G、D5879)；兔抗人單克隆抗體Bax、Caspase8、cleaved-caspase3、AIF(apoptosis inducing factor)、GRP78(glucose regulated protein 78 kDa)、CHOP(C/EBP-homologous protein)(美國Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)分別為：2774S、4790S、9664S、5318S、3177S、5554S)；蛋白分子Marker(德國Fermentas公司，貨號(hào)：26616)；ECL熒光底物(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DW101-02)。

1.3 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國)；免疫印跡凝膠成像儀(Eastman Kodak，美國)；倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)，中國)；FACS Canto TMⅡ流式細(xì)胞儀(BD，美國)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher公司，美國)；6孔培養(yǎng)板(Corning，美國)。

2 方法

2.1 MTT法觀察L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，分別加入0 mol·L-1(單位“mol·L-1”以下均縮略為“M”)、0.625 μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM和40 μM的L50H8和CUR，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥后置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入Formanzan溶解液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

細(xì)胞抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)

2.2 Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×108·L-1，經(jīng)DMSO、20 μM 的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8作用24 h后形成各濃度組，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞1次，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入400 μL的染色緩沖液懸浮細(xì)胞，加入Annexin V和Propidium Iodide(PI)各5 μL混勻，室溫避光染色20 min，流式細(xì)胞儀分析藥物對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響。

2.3 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)用DMSO、20 μM的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8作用于細(xì)胞24 h后形成各濃度組，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的0.01M PBS(pH 7.2)洗滌3次，加入去污裂解緩沖液，在冰上用超聲細(xì)胞破碎機(jī)超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清蛋白液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。各組取相同的蛋白量上樣，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉，加一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗去未結(jié)合的一抗。加二抗(14 000稀釋)室溫?fù)u床孵育2 h。將ECL試劑盒中的A和B試劑等體積混合，滴加到Gel Logic 1500凝膠成像儀上。將 PVDF膜正面朝下，在膜上均勻澆抹ECL發(fā)光液，用保鮮膜平整鋪在PVDF膜上，將膠片壓在保鮮膜上，放入膠片機(jī)中，依次進(jìn)行顯影定影。采用Adobe Photoshop CS3軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果表明，隨著濃度的升高，L50H8和CUR對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率均逐漸上升，呈濃度依賴性，見圖1。相比于CUR，L50H8對(duì)細(xì)胞的抑制率更高，從最低濃度0.625 μM至最高濃度40 μM，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L50H8的IC50為(2.71±0.08) μM，CUR的IC50為(10.27±0.96) μM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.2 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響為了解L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷作用是否與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，采用Annexin V/PI雙熒光染色流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，經(jīng)DMSO、20 μM 的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8處理后的細(xì)胞凋亡率分別為：(4.61±1.41)%，(10.06±1.68)%，(12.71±2.30)%，(25.96±2.01)%和(56.57±1.45)%，L50H8各濃度組與 DMSO 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，L50H8 5 μM組、L50H8 10 μM組與CUR 20 μM組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。上述結(jié)果提示L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，其作用呈濃度依賴性，且強(qiáng)于CUR。見表1，圖2。

注：L50H8與CUR各濃度組抑制率比較,*P<0.05；L50H8與CUR的24 h IC50比較,*P<0.01圖1 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率曲線

注：R3：晚期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI+)，R5：早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)，細(xì)胞凋亡率(%)=(R3+R5)/(R2+R3+R4+R5)×100%圖2 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響

表1 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響

3.3 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為進(jìn)一步研究L50H8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體其作用機(jī)制，用Western Blot法測(cè)定Bax、caspase8、cleaved-caspase3與AIF蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，L50H8能上調(diào)促凋亡因子Bax及AIF的表達(dá)，其效應(yīng)呈濃度依賴性，但對(duì)caspase8蛋白表達(dá)無明顯影響，cleaved-caspase3始終未見表達(dá)，見圖3。

3.4 L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達(dá)的影響為了解L50H8是否能誘發(fā)ERS繼而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，采用Western Blot法測(cè)定ERS啟動(dòng)關(guān)鍵因子GRP78及前凋亡因子CHOP的表達(dá)，結(jié)果表明，L50H8能濃度依賴性地上調(diào)SKOV3細(xì)胞GRP78及CHOP的表達(dá)，且作用效果明顯強(qiáng)于CUR，見圖4。

注：A：Western Blot法檢測(cè)Bax、caspase8、cleaved-caspase3與AIF蛋白的表達(dá)；B：與DMSO組比較，#P<0.05；與CUR 20 μM組比較，#P<0.05圖3 L50H8對(duì)Bax、caspase8與AIF表達(dá)的影響

注：A：Western Blot法檢測(cè)GRP78與CHOP蛋白的表達(dá)；B：與DMSO組比較，①P<0.05；與CUR 20 μM組比較，②P<0.05圖4 L50H8對(duì)GRP78與CHOP表達(dá)的影響

4 討論

近年來，CUR的抗腫瘤作用受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)CUR可以通過抑制新生血管生成及細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)表皮生長因子受體EGFR活性以及HER2的表達(dá)水平，下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB，抑制STAT3信號(hào)通路的激活，下調(diào)COX-2的表達(dá)水平，降低MMP9和iNOS的合成水平等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。但CUR分子是對(duì)稱的雙羰基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差。前期研究團(tuán)隊(duì)在保留CUR活性的基礎(chǔ)上對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到一系列CUR類似物，在其中篩選出穩(wěn)定性和抗腫瘤活性較佳的L50H8作進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)L50H8對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549具有良好的增殖抑制效應(yīng)，IC50為2.83 μmol·L-1。為了解該藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用，本課題組將其作用于SKOV3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)L50H8對(duì)該細(xì)胞同樣具有顯著的抑制作用，且抑制活性明顯優(yōu)于CUR，24 h的IC50低于CUR的1/3，與其在肺腺癌細(xì)胞A549的IC50接近。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種重要過程，能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物研究的重要觀察項(xiàng)目之一。已有研究證實(shí)CUR能誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為CUR類似物的L50H8同樣具有促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡的作用，且其效應(yīng)強(qiáng)于其母體CUR。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要機(jī)制，該機(jī)制被觸發(fā)時(shí)，線粒體內(nèi)膜的通透性孔道開放使線粒體內(nèi)膜通透性增加，細(xì)胞色素c等物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]。在該機(jī)制中，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白家族成員發(fā)揮關(guān)鍵作用，正常情況下，該家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl與線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道結(jié)合，促使線粒體基質(zhì)中的質(zhì)子外流以及ATP/ADP在線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間相互交換，形成正常離子通道，維持線粒體的生理功能。當(dāng)線粒體凋亡機(jī)制被觸發(fā)時(shí)，線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔將Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax集中到自身周圍，使通道孔徑增大，令該非選擇性通道持續(xù)開放，使跨內(nèi)膜的氫離子梯度消失、呼吸鏈解偶聯(lián)，接續(xù)活化下游caspase家族成員如caspase8、caspase9、caspase3等發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。另外，Bax也可通過激活A(yù)IF引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂，引起非典型的細(xì)胞凋亡。AIF是一種具有雙重功能的黃素蛋白，主要存在于線粒體內(nèi)外膜間隙中，當(dāng)細(xì)胞在正常生理狀態(tài)時(shí)，AIF作為線粒體氧化還原酶催化細(xì)胞色素c和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸之間的電子傳遞，既參與線粒體組成，又在能量代謝方面扮演重要角色；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，AIF能在不依賴caspase凋亡因子的情況下，經(jīng)蛋白酶水解形成 57 kD 的成熟AIF，釋放入胞質(zhì)中，經(jīng)由自身的氧化還原區(qū)及親環(huán)素A的輔助作用轉(zhuǎn)位入核，引起染色體凝聚及DNA片段化，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-10]。區(qū)俊文等[11]發(fā)現(xiàn)，CUR能使三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡率增加，Bax、caspase9、caspase3蛋白表達(dá)增強(qiáng)；張啟明等[12]發(fā)現(xiàn)，CUR能通過上調(diào)caspase8 mRNA、Bax、cleaved-caspase9及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡；徐秀鵬等[13]發(fā)現(xiàn)，CUR能通過增加Bax mRNA和AIF mRNA的表達(dá)、活化caspase3和AIF蛋白促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果有所不同，L50H8能上調(diào)SKOV3細(xì)胞Bax及AIF蛋白的表達(dá)，但對(duì)caspase8的表達(dá)無明顯影響，活化凋亡效應(yīng)分子cleaved-caspase3始終未見表達(dá)，提示L50H8對(duì)SKOV3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)不依賴于線粒體caspase通路，主要通過上調(diào)Bax、激活A(yù)IF途徑實(shí)現(xiàn)。與其他研究結(jié)果存在差異性的原因可能在于L50H8與其母體CUR分子結(jié)構(gòu)上的差異，以及藥物所針對(duì)的腫瘤細(xì)胞株不同，確切原因有待進(jìn)一步探究。

ERS是繼線粒體途徑和死亡受體途徑后發(fā)現(xiàn)的另一細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)態(tài)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮正常功能的先決條件。細(xì)胞具有保障內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行正常折疊與修飾的監(jiān)督糾錯(cuò)機(jī)制，當(dāng)錯(cuò)誤折疊的異常蛋白質(zhì)發(fā)生累積，細(xì)胞啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)，包括加強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊、阻斷多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯、加快異常蛋白質(zhì)的降解等。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂持續(xù)，細(xì)胞最終將激活凋亡程序誘導(dǎo)自身凋亡。因ERS會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)折疊異常蛋白質(zhì)的堆積，故與未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)的因子增多常提示ERS的發(fā)生。GRP78是一種分子伴侶，屬于熱休克蛋白70家族成員，在蛋白質(zhì)折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)以及ERS反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。在ERS中，GRP78扮演內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)感受器的重要角色，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78表達(dá)增多并可通過3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白啟動(dòng)其下游的信號(hào)分子CHOP蛋白表達(dá)增加而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故GRP78是ERS啟動(dòng)的關(guān)鍵因子之一。一般認(rèn)為，GRP78表達(dá)增加可作為ERS發(fā)生的分子標(biāo)記物[14]。CHOP是一種特異性ERS轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[15]，是ERS過程中由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號(hào)分子[16]，屬于前凋亡因子，具有直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，CUR能通過ERS通路，上調(diào)GPR78和CHOP蛋白表達(dá)誘導(dǎo)肝癌[18]和肺癌[19]細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，L50H8同樣能使SKOV3細(xì)胞GRP78及CHOP蛋白表達(dá)增強(qiáng)，誘發(fā)ERS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；CUR雖然也能一定程度上調(diào)GRP78和CHOP表達(dá)，然其表達(dá)強(qiáng)度不及L50H8。

綜上，L50H8能顯著地抑制SKOV3細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)可能通過上調(diào)Bax、激活A(yù)IF以及誘發(fā)ERS實(shí)現(xiàn)，但不依賴于線粒體caspase通路。