吳夢(mèng)雪，彭濤，崔亞新，趙麗君

山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西 太原 030024

中藥是我國寶貴的資源，在豐富的中醫(yī)理論指導(dǎo)下，從整體與局部關(guān)聯(lián)的角度出發(fā)，通過藥物中有效成分的體內(nèi)代謝，實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)機(jī)體的系統(tǒng)調(diào)控[1]。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究中藥的藥效成分、潛在作用靶點(diǎn)，突破了傳統(tǒng)研究的不足，具有快速靈活、準(zhǔn)確率更高的特點(diǎn)[2]。敗醬草又稱鹿腸、澤敗、苦菜等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、苦，性微寒，具有清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛之功，常用于腸癰、肺癰、疔瘡腫毒等。王登等[3]通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，敗醬草常與赤芍、蒲公英等清熱解毒、化瘀止血類的中藥配伍，治療以帶下病、腹痛及淋證最為常見，證候以濕熱下注、瘀血內(nèi)阻為主。孫桂芝教授[4]運(yùn)用紅藤、敗醬草作為治療大腸癌的藥對(duì)，有清熱解毒、活血祛瘀的功效。姜良鐸教授[5]運(yùn)用敗醬草配赤、白芍等作為治療大腸癌的核心用藥。張冰教授[6]根據(jù)腫瘤患者正邪之氣偏盛的不同，將治療分為“扶正固本法、祛邪法和護(hù)肝腎”三法，認(rèn)為邪氣偏盛的癌癥患者常伴有痰瘀、熱毒等特點(diǎn)，選用魚腥草、敗醬草、白花蛇舌草等。張青教授[7]以“肺與大腸相表里”為理論基礎(chǔ)，以薏苡敗醬三仁湯為主，應(yīng)用方中敗醬草改善腸道炎性環(huán)境治療直腸癌術(shù)后患者的前切除綜合征。成分是中藥發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，靶點(diǎn)是藥物與疾病的紐帶。本文將應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究敗醬草治療大腸癌的主要活性成分和作用靶點(diǎn)，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探索與分析。

1 資料與方法

1.1 篩選敗醬草關(guān)鍵成分通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)獲取敗醬草化合物，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)特性參數(shù)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，其中OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機(jī)體吸收進(jìn)入血液循環(huán)的相對(duì)量和速率；DL反映化合物中的特定功能基團(tuán)與已知藥物的相似性；二者對(duì)中藥化學(xué)成分活性的評(píng)估具有重要意義[8]。同時(shí)對(duì)敗醬草的作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，將所收集的靶點(diǎn)匯總并去除重復(fù)靶點(diǎn)，即為藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2 篩選敗醬草與大腸癌基因名稱在Uniprot數(shù)據(jù)庫中，輸入敗醬草關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名稱，限定物種為“human”，將得到的結(jié)果導(dǎo)出并整理。在Drugbank、OMIM與TTD數(shù)據(jù)庫中以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞查詢大腸癌的基因，并取三者合集。

1.3 藥物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將敗醬草關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)分別編秩，將編好的網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，建立藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析敗醬草成分中起關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了闡明關(guān)鍵蛋白質(zhì)之間的相互作用，將篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，以高置信度≥0.700為條件導(dǎo)出，并導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，其中靶點(diǎn)的度值表示相互作用的靶點(diǎn)數(shù)。

1.5 GO功能、KEGG通路富集分析運(yùn)用Metascape3.8.0數(shù)據(jù)庫對(duì)敗醬草抗大腸癌的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能和KEGG富集通路分析，篩選P<0.05的GO功能和KEGG通路。

2 結(jié)果

2.1 敗醬草化合物與靶點(diǎn)篩選結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到敗醬草全部活性成分共52種，以 OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，得到關(guān)鍵成分13種，見表1。同時(shí)查詢TCMSP數(shù)據(jù)庫的敗醬草關(guān)鍵成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，獲得422個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到209個(gè)靶點(diǎn)，其中一種成分黃草烏堿丙(vilmorrianineC)無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，故舍棄。

表1 敗醬草關(guān)鍵成分篩選結(jié)果

2.2 敗醬草治療大腸癌的基因匯集運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫將與敗醬草靶點(diǎn)進(jìn)行基因名匹配，去除無法匹配的基因后，共406個(gè)基因，去除重復(fù)基因后，共209個(gè)。在GeneCards、Drugbank、OMIM與TTD數(shù)據(jù)庫中以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞查詢大腸癌基因，分別查詢到25、200、87個(gè)基因名。對(duì)以上基因去重復(fù)，得到295個(gè)相關(guān)基因合集，與敗醬草209個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集后，得到33個(gè)共同基因，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)交集

2.3 敗醬草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。以敗醬草12個(gè)主要活性成分及其去重后靶點(diǎn)共計(jì)209個(gè)，在該成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，共有222個(gè)節(jié)點(diǎn)，418條邊，以度值大小作為敗醬草活性成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與靶點(diǎn)間相互聯(lián)系的程度，度值越大，說明該成分或靶點(diǎn)在敗醬草作用機(jī)制中有重要作用。如圖2所示，黃色為藥物，綠色為敗醬草活性成分，橘色為藥物靶點(diǎn)，成分中MOL000098(槲皮素)度值為150，MOL000422(山柰酚)度值為61、MOL000006(木犀草素)度值為57、MOL000358(β谷甾醇)度值為37、MOL000449(豆甾醇)度值為31，說明敗醬草在治療大腸癌時(shí)，槲皮素、山柰酚等成分起關(guān)鍵作用。同時(shí)，PTGS 2(前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2)度值為10、NCOA2(核受體共激活劑2)度值為8，TOP2A(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2A)度值為7，AR(雄激素受體)度值為7，說明敗醬草一個(gè)成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)多個(gè)成分，體現(xiàn)了敗醬草多組分、多靶點(diǎn)治療大腸癌的特點(diǎn)。

圖2 敗醬草成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，含有33個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，其中F7為游離節(jié)點(diǎn)不參與蛋白互作，共140條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值8.48。將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析，紅色圓圈代表蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，圓圈越大說明度值越大，也就是與其相互作用的蛋白質(zhì)越多。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，共篩選出14個(gè)蛋白，敗醬草靶點(diǎn)中TP53(腫瘤P53蛋白，度值25)、AKT1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，度值19)、CASP3(半胱氨酸蛋白酶，度值16)、CCND1(G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白D1，度值16)、VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子，度值15)、PTEN(磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3-磷酸酶和雙特異性蛋白磷酸酶PTEN，度值15)、MYC(MYC原癌基因蛋白度，值15)等蛋白質(zhì)間連線密集，說明敗醬草在治療大腸癌，這些蛋白相互作用較為密切，是關(guān)鍵蛋白，見圖3。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 敗醬草GO功能分析根據(jù)lgP值篩選的得到的前20條生物過程，顯示敗醬草的生物過程主要有對(duì)雌二醇應(yīng)答、細(xì)胞對(duì)藥物應(yīng)答、上皮細(xì)胞增殖、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、凋亡過程中半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的調(diào)節(jié)等，見圖4。其細(xì)胞組分表示其作用部位可能在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腔、膜筏、核染色體、細(xì)胞質(zhì)等。

2.6 KEGG富集分析結(jié)果KEGG的分析結(jié)果中，經(jīng)lgP值篩選后，富集信號(hào)主要集中在癌癥通路、乙肝、癌癥中的p53信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等，見圖5。涉及基因數(shù)目最多的前10條通路為Pathways in cancer癌癥的途徑、Hepatitis B(乙型肝炎)、MicroRNAs in cancer(癌癥中的微小RNA)、Proteoglycans in cancer(癌癥中的蛋白聚糖)、HTLV-I infection(HTLV-I感染)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑)、Prostate cancer(前列腺癌)、Pancreatic cancer(胰腺癌)、Endocrine resistance(內(nèi)分泌抵抗力)、Breast cancer(乳腺癌)，與各種惡性腫瘤通路相關(guān)密切，見表2。

圖5 敗醬草KEGG富集分析

表2 靶點(diǎn)富集較多的通路

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示[9]，低收入國家和中等收入的國家發(fā)病率較發(fā)達(dá)國家增長趨勢(shì)更明顯，城市發(fā)病率比農(nóng)村高，東部地區(qū)比西部地區(qū)高，男性比女性高。研究顯示[10]，結(jié)直腸癌發(fā)病率的上升速度與社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展密切相關(guān)，人類發(fā)展指數(shù)升高，疾病的發(fā)病率也隨之升高。研究表明，敗醬草含有氨基酸、蛋白質(zhì)、酚類、黃酮類、香豆素、皂苷等等多種活性成分[11]，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，如人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人乳腺癌(MCF7)、宮頸癌細(xì)胞(U14)、人宮頸癌Hela細(xì)胞[12-14]。劉洋成[15]發(fā)現(xiàn)，白花敗醬草可促進(jìn)HepG2、A549細(xì)胞凋亡，與濃度成正比，且能損傷人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)的DNA染色體、誘導(dǎo)其停滯于細(xì)胞周期的G2/M期。沈德鳳等[16]發(fā)現(xiàn)，黃花敗醬草總苷水提取物可抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。鄭昌杰[17]發(fā)現(xiàn)，黃花敗醬提取物能促進(jìn)大鼠腸道蠕動(dòng)，且其對(duì)減輕小鼠疼痛有良好的效果，還可減輕腸道的炎癥環(huán)境[18]。騰陽等[19]用敗醬草合劑聯(lián)合電針治療潰瘍性結(jié)腸炎有改善作用。毛俊琴等[20]發(fā)現(xiàn)，敗醬草中的環(huán)烯醚萜苷元可抑制小鼠的腫瘤細(xì)胞株增殖。孫燕[21]發(fā)現(xiàn)，敗醬草能抑制HEPAL-6細(xì)胞的增殖。錢彩云等[22]發(fā)現(xiàn)，敗醬草聯(lián)合救必應(yīng)可緩解DNA甲基化導(dǎo)致的結(jié)腸炎癥相關(guān)性腸癌。根據(jù)“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇等成分可作用多個(gè)藥物靶點(diǎn)。藥理研究已證明[23]，黃酮、黃酮醇類化合物能通過調(diào)控自噬相關(guān)基因達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的作用，如槲皮素主要通過抑制 COX-2的表達(dá)、抑制C(PKC)的活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化來發(fā)揮抗癌作用[24-25]；山柰酚則通過影響癌細(xì)胞周期、抑制癌細(xì)胞增殖、激活細(xì)胞表面凋亡受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-27]；木犀草素主要能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[28]。化合物靶點(diǎn)中的TP53是人體的抑癌基因之一，在DNA損傷或癌基因表達(dá)時(shí)被激活，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯、損傷的修復(fù)及細(xì)胞凋亡的過程，從而維持基因組的穩(wěn)定與機(jī)體的穩(wěn)態(tài)[29]。AKT1是ATK家族一個(gè)重要的亞型，能抑制上皮癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。CCND1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白，基因此沉默可以阻滯G1-S的細(xì)胞周期進(jìn)程，削弱癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[30]。PTEN的抑癌主要通過去磷酸化細(xì)胞質(zhì)膜上的脂質(zhì)分子PIP3，從而拮抗P13K-AKT通路，抑制細(xì)胞生長、増殖，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，達(dá)到抑癌[31]。MYC是人體中可將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子之一，與VEGFA啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)VEGFA產(chǎn)生并隨后萌發(fā)血管生成，與腫瘤干細(xì)胞有密切關(guān)系[32]。

本研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草對(duì)大腸癌的活性成分主要是黃酮類，如槲皮素、木犀草素、山柰酚等，且這些成分能作用于多個(gè)疾病靶點(diǎn)，但此文只對(duì)符合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的成分進(jìn)行了分析，對(duì)某些敗醬草中有確切治療意義，卻不符合篩選條件的成分可能有遺漏，需要進(jìn)一步的研究。