李文俊，李 強(qiáng)，鐘良明

（1. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 韶關(guān)金粵水產(chǎn)科技有限公司， 廣東 韶關(guān) 512335）

光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）倒刺鲃屬（Spinibarbus），主要分布于我國(guó)華東和華南各水系中[1-3]。光倒刺鲃肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，是一種重要的名優(yōu)經(jīng)濟(jì)魚類[4]。其隨著人工馴養(yǎng)成功及多年的繁育推廣，該品種已成為華南及華東等地重要的養(yǎng)殖魚類之一。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染及水利工程建設(shè)等原因，光倒刺鲃自然種群資源量不斷減少，在我國(guó)許多江河已難覓其蹤跡。面對(duì)這個(gè)現(xiàn)狀，相關(guān)部門已經(jīng)在一些主要分布水域建立光倒刺鲃自然保護(hù)區(qū)，對(duì)其加以保護(hù)，其中珠江水系中主要分布在流溪河、增江和漓江水 系[5-6]。目前對(duì)光倒刺鲃的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)與繁殖[7]、生長(zhǎng)特征[8]、功能基因[9-10]、線粒體基因組[11]等方面，而有關(guān)群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及親緣地理關(guān)系等方面的研究報(bào)道較少[12-13]。

線粒體DNA 具有母系遺傳、進(jìn)化速度快和復(fù)制相對(duì)獨(dú)立等特點(diǎn)，通常能夠有效反映種群的遺傳變異，是研究動(dòng)物群體遺傳學(xué)的合適分子標(biāo)記[14]。部分線粒體基因已成為群體遺傳學(xué)研究常用的分子標(biāo)記，如：12SrRNA、16SrRNA、COI、Cyt b 基因和CR 區(qū)等[15-18]。而細(xì)胞色素b 基因（Cytochrome b gene，Cyt b）進(jìn)化速率適中，是線粒體13 個(gè)蛋白編碼基因中結(jié)構(gòu)和功能被研究得最為清楚的基因之一，特別適用于不同區(qū)域種群水平差異的檢測(cè)[19]。筆者采集珠江流域7 個(gè)光倒刺鲃群體共計(jì)241 個(gè)樣本，通過(guò)測(cè)定和分析其線粒體Cyt b 基因序列，旨在更全面了解珠江流域光倒刺鲃遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，為合理進(jìn)行光倒刺鲃漁業(yè)資源保護(hù)和利用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

光倒刺鲃樣品為2017—2018 年分別采自廣東省廣州市增城區(qū)（ZC）、廣州市從化區(qū)（CH）、廣東省韶關(guān)市（SG）、廣東省陽(yáng)山縣（YS）、廣西桂林市（GL）、廣西河池市（HC）和廣西崇左市（CZ），共計(jì)7 個(gè)群體241 尾，每個(gè)群體確保有30 尾以上以減少試驗(yàn)誤差，并以地名拼音簡(jiǎn)寫作為群體編號(hào)。樣品鑒定根據(jù)《中國(guó)動(dòng)物志 硬骨魚綱 鯉形目》（下卷）[3]和《廣東淡水魚類志》[2]進(jìn)行。詳細(xì)樣品信息見(jiàn)表1，采樣點(diǎn)如圖1 所示。

1.2 DNA 的提取及測(cè)序

光倒刺鲃基因組DNA 使用DNA 抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）提取。PCR 擴(kuò)增采用自行設(shè)計(jì)的引物，其正反向引物序列分別為：F：5'-AG GAGAGGGATTAGACGCAA-3'；R：5'-GGGAGTTAGGG GCGGAAG-3'。25 μL PCR 反應(yīng)體系包括：12.5 μL 2× Taq PCR Master Mix [0.1 U Taq DNA Polymerase/mL、500 mmol/L dNTP each、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.7）、20 mmol/L KCl、4 mmol/L MgCl2]、3 μL 模板DNA、1 μL 引物（10 mmol/L）和7.5 μL ddH2O。PCR 程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 結(jié)果用1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)后，由上海生工生物公司進(jìn)行純化、測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)DNASTAR Lasergene SeqMan Pro 程序[20]對(duì)序列進(jìn)行拼接。使用Muscle 軟件對(duì)已拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析，并輔以人工校對(duì)。利用MEGA 6.0[21]軟件計(jì)算堿基組成特點(diǎn)和遺傳距離?；贙imura's-2-parameter 模型構(gòu)建單倍型鄰接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)化樹[22]。通過(guò)DnaSP 6.0 軟件[23]和Arlequin 3.5軟件包[24]統(tǒng)計(jì)各群體的核苷酸多樣性（π）、單倍型多樣性（Hd）、遺傳分化系數(shù)（Fst）、分子變異分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）和中性檢驗(yàn)。使用Network 10.0 軟件[25]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

圖1 光倒刺鲃采樣點(diǎn)

表1 不同群體光倒刺鲃樣品的采樣點(diǎn)分布和遺傳多樣性

研究共得到241 條光倒刺鲃完整線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因序列，其長(zhǎng)度為1 141 bp，其中T、C、A、G 占比分別為28.6%、27.7%、29.5%和14.2%，而G的含量明顯低于其他3 種堿基。241 條序列中共有37個(gè)變異位點(diǎn)，包含35 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和2 個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，無(wú)堿基插入或缺失情況。

2.2 遺傳多樣性分析

在241 條Cyt b 序列中，共定義了9 個(gè)單倍型（表1），其中4 個(gè)單倍型（H1、H2、H3、H4）為多群體共享的單倍型，尤其是單倍型H2由5個(gè)群體共享（CH、SG、YS、HC、CZ），另 有4 個(gè) 單 倍 型（H5、H6、H7、H8）為單個(gè)群體內(nèi)多個(gè)個(gè)體共享，其余1 個(gè)單倍型（H9）僅存在于單個(gè)個(gè)體中?？傮w單倍型多樣性為0.768±0.012。其中，陽(yáng)山（YS）群體的單倍型多樣性（0.597±0.059）最高，從化（CH）群體（0.541±0.071）、韶關(guān)（SG）群體（0.546±0.034）次之，而增城（ZC）群體（0）和桂林（GL）群體（0）最低；總體核苷酸多樣性為0.010 5±0.005 2，其中韶關(guān)（SG）群體 （0.013 5±0.006 9）最高，從化（CH）群體（0.010 5± 0.005 4）次之，而增城（ZC）群體（0）和桂林（GL）群體（0）最低。

2.3 遺傳距離及遺傳分化

對(duì)241 條Cyt b 序列進(jìn)行群體遺傳距離和遺傳分化指數(shù)分析，結(jié)果（表2）顯示，7 個(gè)光倒刺鲃群體間的遺傳距離為0.000 4～0.027 9，增城（ZC）群體與桂林（GL）群體間遺傳距離最大，桂林（GL）群體與崇左（CZ）群體間遺傳距離最小，其中增城（ZC）群體與其他群體間的遺傳距離普遍比其他群體間距離大，為0.013 9～0.027 9；群體內(nèi)的遺傳距離為0（ZC、GL）～ 0.013 9（SG），群體內(nèi)遺傳距離明顯比群體間小。7個(gè)光倒刺鲃群體間的遺傳分化指數(shù)為0.066 2～1.000 0，增城（ZC）與桂林（GL）群體間遺傳分化指數(shù)最大，增城（ZC）與河池（HC）群體間次之，崇左（CZ）與桂林（GL）群體間最小，除了崇左（CZ）與桂林（GL）、韶關(guān)（SG）與從化（CH）群體間存在較低的遺傳分化外（0.05 ＜Fst ＜0.15），其他群體間均存在高度遺傳分化（Fst ＞0.25）[26]，而增城（ZC）群體與其他群體間遺傳分化指數(shù)（0.503 1～1.000 0）普遍比較大。

表2 基于Cyt b序列光倒刺鲃的群體間遺傳距離（對(duì)角線下）、群體內(nèi)遺傳距離（對(duì)角線）和遺傳分化指數(shù)（對(duì)角線上）

2.4 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

為了更好地了解光倒刺鲃的種群遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)9個(gè)單倍型進(jìn)行親緣關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果（圖2）顯示，親緣關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖呈典型的星狀分布，且各群體單倍型的聚集呈一定遞進(jìn)排列關(guān)系。上部分的單倍型主要來(lái)自西江水系（GL、HC、CZ）的群體或由西江與北江群體共享的單倍型，接著依次分布著北江水系（CH、SG、YS）群體特有單倍型，和北江與東江水系共享的單倍型。大多數(shù)單倍型之間只有1～2 步的變異，這些單倍型間親緣關(guān)系較近。而東江水系（ZC）群體與部分北江水系（CH、SG）群體共享的單倍型H1 與其他單倍型間變異步數(shù)較大，達(dá)到27 步以上，說(shuō)明單倍型H1 與其他單倍型間遺傳分化較大。

圖2 基于Cyt b 基因的光倒刺鲃群體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析

為更好地探討光倒刺鲃群體間的親緣關(guān)系，構(gòu)建9 個(gè)單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖3）顯示，9 個(gè)單倍型聚集成A、B 2 個(gè)支系。其中支系A(chǔ) 包含a、b 2 個(gè)小分支，分支a 包含西江水系群體特有的單倍型（H6、H7、H8）和西江與北江水系群體共享的單倍型（H2、H3），分支b 包含北江水系群體特有的單倍型（H4、H5）；支系B 包含CZ 個(gè)體特有的單倍型H9 和東江與部分北江水系群體共享的單倍型H1。

圖3 光倒刺鲃群體基于Cyt b 基因序列的鄰接法（NJ）進(jìn)化樹

2.6 分子變異分析（AMOVA）

通過(guò)AMOVA 可分析光倒刺鲃群體的變異分布模式[27]。將分布于東江水系（ZC 群體）、北江水系（CH、SG、YS 群體）和西江水系（GL、HC、CZ 群體） 的群體劃分為3 個(gè)地理組群進(jìn)行AMOVA 分析，結(jié)果如表3 所示，各區(qū)域分組之間的變異占61.32%，各區(qū)域分組內(nèi)僅占12.66%，各采樣群體內(nèi)變異占26.02%， 表明7 個(gè)群體光倒刺鲃Cyt b 序列的遺傳分化主要來(lái) 自于各地理分組之間和各群體內(nèi)；各分組間（FCT=0.634 6， P ＜0.01）和各群體內(nèi)（FST=0.696 0，P ＜0.01）的種群分化指數(shù)較高，各分組內(nèi)（FSC=0.158 1，P ＜0.01）種群分化指數(shù)較低。

表3 光倒刺鲃分子變異（AMOVA）分析

2.7 種群動(dòng)態(tài)分析

通過(guò)中性檢驗(yàn)分析可推斷種群是否經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張事件。如果Tajima's D 與Fu's Fs 都為負(fù)值，且具有統(tǒng)計(jì)顯著性，說(shuō)明序列偏離了中性進(jìn)化模型，該研究種群可能經(jīng)歷過(guò)擴(kuò)張事件[28-29]。該研究對(duì)241 條Cyt b 序列進(jìn)行中性檢驗(yàn)分析，結(jié)果（表4）顯示，崇左（CZ）的Tajima's D 為顯著性負(fù)值，但其Fu's Fs 檢驗(yàn)為正值，其余群體的Tajima's D 和Fu's Fs 檢驗(yàn)均為正值或?yàn)樨?fù)值但統(tǒng)計(jì)不顯著（P ＞0.05）。這表明這珠江水系光倒刺鲃種群數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，近期沒(méi)有發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張。

表4 基于Cyt b 序列光倒刺鲃群體的Tajima’s D 和Fu’s Fs 檢驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性指生物種內(nèi)的遺傳差異程度，是生命進(jìn)化和適應(yīng)的基礎(chǔ)。豐富的遺傳多樣性能提高種群適應(yīng)多樣環(huán)境的能力，維持其穩(wěn)定性，而缺乏遺傳多樣性會(huì)導(dǎo)致種群的生存面臨威脅[30]。該研究241 尾光倒刺鲃樣品的Cyt b 序列中，共有37 個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，定義了9個(gè)單倍型；總體單倍型多樣性為0.768±0.012，總體核苷酸多樣性為0.010 5±0.005 2。依據(jù)Grant等[31]對(duì)魚類線粒體DNA 序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性的大小劃分，北江支流的3 個(gè)群體（CH、SG、YS）具有中等的單倍型多樣性，韶關(guān)（SG）群體和從化（CH）群體具有中等核苷酸多樣性，其余群體具有較低的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，尤其是增城（ZC）群體和桂林（GL）群體表現(xiàn)為非常低的單倍型多樣性和核苷酸多樣性。這表明珠江水系光倒刺鲃的遺傳多樣性整體處于較低水平，各群體中除了從化（CH）和韶關(guān)（SG）處于中等水平的遺傳多樣性外，其他5 個(gè)群體均表現(xiàn)為較低的遺傳多樣性。而中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，光倒刺鲃種群數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，近期未發(fā)生種群擴(kuò)增。因此，造成珠江水系光倒刺鲃群體多樣性降低的原因，可能是珠江水系的光倒刺鲃種質(zhì)資源受到了較嚴(yán)重的破壞。一方面，環(huán)境污染和不合理的捕撈方式可能直接導(dǎo)致其野生種質(zhì)資源逐漸減少。另外，隨著珠江流域大規(guī)模的水利建設(shè)，光倒刺鲃棲息環(huán)境不斷萎縮和碎片化，其群體間基因交流受阻，這是珠江水系光倒刺鲃群體多樣性降低的另一主要原因。為防止珠江流域光倒刺鲃種質(zhì)資源的衰退，亟需采取有效的保護(hù)措施，保護(hù)其遺傳多樣性，以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的可持續(xù)利用[32-33]。北江水系群體具有較高的群體遺傳多樣性，應(yīng)將其作為重點(diǎn)保護(hù)區(qū)域。

3.2 光倒刺鲃群體遺傳分化

遺傳距離可反映不同種群或物種間的遺傳變異程度。該研究中，光倒刺鲃各群體之間的遺傳距離為0.000 4～0.027 9。其中增城（ZC）與其他群體間遺傳距離為0.013 9～0.027 9，普遍比其他群體間距離大，表明增城（ZC）與其他群體間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。遺傳分化指數(shù)（Fst）常用于劃分群體間的分化程度[26]，此研究7個(gè)光倒刺鲃群體間的Fst為0.066 2～1.000 0 （P＜ 0.05），除了韶關(guān)（SG）與從化（CH）、崇左（CZ）與桂 林（GL）群體間存在較低的分化程度（0.05 ＜Fst ＜ 0.15）外，其他群體之間均存在高度的遺傳分化（Fst ＞ 0.25）[26]，尤其是增城（ZC）群體與其他群體間均具有較高的遺傳分化指數(shù)（0.503 1～1.000 0），進(jìn)一步說(shuō)明增城（ZC）與其他群體間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。把7 個(gè)群體劃分成東江水系、北江水系和西江水系3 個(gè)區(qū)域分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，AMOVA 分析顯示，大部分（61.32%）的分子遺傳變異來(lái)自于各地理分組之間，且各水系之間的群體遺傳分化指數(shù)較大，表明這些水系之間的光倒刺鲃具有較明顯的遺傳分化。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，絕大多數(shù)單倍型間只有1～2步的變異，說(shuō)明這些單倍型間遺傳分化較小。其中H2 屬于北江（CH、SG、YS）和西江（HC、CZ）水系5 個(gè)群體共享的單倍型，其共享群體數(shù)最多，單倍型出現(xiàn)頻率也最高（70 次），推測(cè)其為中心單倍型，其他單倍型可能由H2 突變演化而成。而H2 單倍型分化成H1 時(shí)，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖上出現(xiàn)30 步的變異，H1 與H2 單倍型間產(chǎn)生較大的遺傳分化。單倍型H1由增城（ZC）群體和北江水系（CH 和SG 群體）部分個(gè)體組成。這表明光倒刺鲃北江水系群體分別與東江和西江水系的群體具有較近的親緣關(guān)系，而東江水系群體與西江水系群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

單倍型NJ 樹分析表明，9 個(gè)光倒刺鲃單倍型聚為A、B 2 個(gè)支系。其中A 分支中，由西江水系群體特有的單倍型和部分西江與北江水系群體共享的單倍型共同聚為一個(gè)小支系，再進(jìn)一步與北江特有的單倍型聚為A 支系，節(jié)點(diǎn)支持率為98%，也說(shuō)明北江水系群體與西江群體親緣關(guān)系較近；支系B 主要是北江與東江群體共享的單倍型。這表明北江光倒刺鲃群體分別與東江、西江群體親緣關(guān)系較近，而東江與西江群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

從地理位置上看，西江與北江干流通過(guò)思賢滘聯(lián)通，北江的光倒刺鲃群體可與西江群體發(fā)生基因交流，使得它們親緣關(guān)系比較近。而獅子洋將東江與北江連接、并與西江隔離開來(lái)，間冰期海平面上升時(shí)，使東江與西江和北江群體發(fā)生隔離[34-35]，而后面時(shí)期東江水系的光倒刺鲃?dòng)挚梢栽诔毕惶鏁r(shí)，通過(guò)獅子洋與北江群體接觸，使得東江水系與北江水系的群體發(fā)生一定基因交流。因而，珠江流域復(fù)雜的地形地貌導(dǎo)致光倒刺鲃形成了較明顯的地理隔離。