劉子韓 劉志豪 周雨揚(yáng) 許驍 李澤衍 周麗平 江洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心臟自主神經(jīng)研究中心 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060)

心血管疾病是目前最常見的疾病及死亡因素之一[1]，而社會壓力引起的長期情緒應(yīng)激在增加心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)和影響疾病預(yù)后中起著重要作用[2]。目前已有大量臨床研究表明，長期的抑郁情緒會通過改變機(jī)體神經(jīng)免疫功能從而加重心臟功能障礙及促進(jìn)心肌重構(gòu)[3]，而良好地緩解壓力可很好地促進(jìn)患者心肌梗死后心肌損傷修復(fù)及改善預(yù)后[4]。在這種壓力下，大腦中主要激活的情緒核團(tuán)包括下丘腦、杏仁核和孤束核等[5]。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamus，VMH)是大腦中調(diào)控進(jìn)食、能量代謝和情緒的關(guān)鍵腦區(qū)[6-8]。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核腹外側(cè)區(qū)(ventrolateral part of ventromedial hypothalamus，VMHVL)是VMH中主要介導(dǎo)攻擊行為和憤怒情緒的關(guān)鍵核團(tuán)亞區(qū)，VMHVL活性的升高可直接誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生攻擊行為與憤怒情緒，而抑制其活性可降低大鼠的活動性[9]。目前關(guān)于情緒應(yīng)激行為對心臟影響的動物和臨床研究已有大量報(bào)道，但較少關(guān)注情緒核團(tuán)與心臟的關(guān)系，而研究這種關(guān)系最直接的方法就是特異性激活特定核團(tuán)來觀察其對心臟的影響。本研究通過化學(xué)遺傳技術(shù)精準(zhǔn)激活憤怒情緒相關(guān)核團(tuán)VMHVL，利用腦立體定位技術(shù)將激活型的化學(xué)遺傳病毒[rAAV-hSyn-hM3D(Gq)-EGFP-WPRE-pA]精準(zhǔn)表達(dá)在VMHVL腦區(qū)中，并于腹腔注射氯氮平一氧化氮(clozapine N-oxide，CNO)激活神經(jīng)元上表達(dá)的hM3D(Gq)受體從而激活VMHVL，連續(xù)干預(yù)14 d后檢測其對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核并批準(zhǔn)。10只健康成年SD大鼠(體重200～250 g)由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，將10只大鼠隨機(jī)分為激活組(n=5)和對照組(n=5)。在SPF環(huán)境分籠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每日給予充足標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食禁飲12 h，在實(shí)驗(yàn)過程中保持環(huán)境安靜，室溫保持在(22±2)℃。

1.2 VMHVL腦立體定位注射

用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將頭部剃毛并固定。碘伏消毒后切開頭皮，用過氧化氫去除腦膜并暴露顱骨人字縫和矢狀縫。定位針端以前囟為定位原點(diǎn)(X=0 mm，Y=0 mm，Z=0 mm)，查閱圖譜可得VMHVL核團(tuán)中心坐標(biāo)為(X=0.8 mm，Y=-2.76 mm，Z=9.8 mm)。根據(jù)VMHVL定位在右側(cè)顱骨鉆孔，并將吸取病毒的微量注射針針尖調(diào)整至VMHVL所在坐標(biāo)處。在激活組右側(cè)VMHVL以10 nL/min緩慢注射rAAV-hSyn-hM3D(Gq)-EGFP-WPRE-pA；AAV2/9(2.0×1012viral particles/mL，200 nL，樞密科技，中國武漢)。在對照組相同位置注射等量rAAV-hSyn-EGFP-WPRE-pA；AAV2/9。注射完畢停留10 min后緩慢退出微量注射針，完成定位注射。傷口縫合后將大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3周，保證病毒高度表達(dá)。

1.3 心肌梗死模型構(gòu)建

病毒注射3周后，將激活組與對照組的大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺上，連接至小動物呼吸機(jī)并給予正壓通氣。經(jīng)左前胸剃毛、消毒后打開胸腔，暴露心臟。打開心包，暴露左心耳，肉眼可見左心耳下方有一往下走行的左冠狀動脈前降支，結(jié)扎后可見結(jié)扎部位以下心肌明顯缺血。關(guān)胸后密切關(guān)注生命體征，等待大鼠清醒。

1.4 超聲心動圖測量

心肌梗死造模后，激活組與對照組均連續(xù)14 d腹腔注射CNO[3 mg/kg，2 mL/(次·d)]。14 d后將大鼠麻醉后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺，左前胸剃毛，測定心臟二維超聲心動圖，分別測量左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、左室舒張末期容積(LVEDV)和左室收縮末期容積(LVESV)。

1.5 VMHVL核團(tuán)激活、血清去甲腎上腺素及免疫熒光檢測

處死大鼠之前，打開腹腔并從下腔靜脈收集外周血，以3 000 r/min離心15 min并提取血清，儲存于-80 ℃環(huán)境下，之后采用ELISA試劑盒進(jìn)行血清去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)含量測定，檢測步驟根據(jù)試劑盒說明書操作。處死大鼠后，將腦組織完全取下，浸泡在多聚甲醛中保存，脫水后在VMHVL腦區(qū)取5 μm冰凍切片進(jìn)行熒光分析。增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)為自發(fā)免疫熒光，直接在熒光顯微鏡下觀察。使用C-FOS抗體(Abcam，英國劍橋)和兔抗二抗對腦區(qū)C-FOS進(jìn)行免疫熒光染色并在熒光顯微鏡下觀察。全程操作注意避光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 8.0系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與作圖。先對所有計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)以明確是否符合正態(tài)分布，再采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，將P<0.05定義為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組干預(yù)對VMHVL神經(jīng)元活性的影響

激活組和對照組SD大鼠在接受VMHVL化學(xué)遺傳病毒注射3周后，發(fā)現(xiàn)VMHVL處有大量綠色熒光蛋白表達(dá)，見圖1A。兩組均腹腔注射CNO后，激活組VMHVL神經(jīng)元活性顯著高于對照組(標(biāo)準(zhǔn)化C-FOS計(jì)數(shù)，激活組vs對照組：1.40±0.08 vs 1.00±0.09，P<0.01)，見圖1B和圖1C。

2.2 VMHVL激活對外周交感神經(jīng)活性的影響

激活組和對照組SD大鼠接受CNO注射2周后，取外周血清檢測NE活性。發(fā)現(xiàn)激活組大鼠血清中的NE相較于對照組，NE的濃度被VMHVL的化學(xué)遺傳激活效應(yīng)升高[激活組vs對照組：(4 372.26±221.10) pg/mL vs (2 018.47±466.89) pg/mL，P<0.001]。見圖1D。

注：圖A左一(1 000 μm)：該視野下轉(zhuǎn)染了化學(xué)遺傳病毒的VMHVL層面全腦腦片EGFP熒光圖，白色虛線區(qū)域?yàn)閂MH，白色箭頭所指部位為VMHVL；圖A左二(200 μm)：該視野下轉(zhuǎn)染了化學(xué)遺傳病毒的右側(cè)下丘腦局部EGFP熒光圖，白色虛線區(qū)域?yàn)閂MHVL；圖A左三(20 μm)：該視野下轉(zhuǎn)染了化學(xué)遺傳病毒的VMHVL局部EGFP熒光圖，白色箭頭所指為轉(zhuǎn)染腺病毒后表達(dá)的EGFP的神經(jīng)細(xì)胞；圖B(20 μm)：兩組大鼠VMHVL中C-FOS表達(dá)；圖C：兩組C-FOS陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)，**：P<0.01；圖D：兩組外周血清中NE濃度(pg/mL)，****：P<0.001。Merge:熒光圖疊加C-FOS+DAPI；DAPI：4’，6-二瞇基-2-苯基吲哚。圖1 VMHVL中化學(xué)遺傳病毒轉(zhuǎn)染、神經(jīng)元激活情況以及外周循環(huán)交感神經(jīng)激活情況

2.3 VMHVL激活對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

心肌梗死后兩周，測定大鼠二維超聲心動圖，見圖2A。超聲心動圖顯示，激活組大鼠對比對照組大鼠，LVEF明顯降低[(63.60±2.12)% vs (44.90±6.39)%，P<0.005]，LVFS明顯降低[(29.39±3.36)% vs (19.62±3.27)%，P<0.01]。LVEDd顯著增寬[(8.36±0.55) mm vs (6.54±0.54)mm，P<0.01]，LVESd也顯著增寬[(6.74±0.50) mm vs (4.38±0.48) mm，P<0.005]。此外，LVEDV明顯增加[(1.28±0.21) mL vs (0.65±0.15) mL，P<0.001]，LVESV也明顯增加[(0.70±0.15) mL vs (0.22±0.08) mL，P<0.001]。見圖2B。

3 討論

下丘腦是大腦皮層下植物神經(jīng)的最高中樞，可調(diào)節(jié)包括心臟在內(nèi)的許多內(nèi)臟的生理活動。有研究表明，下丘腦可從經(jīng)典的情緒相關(guān)核團(tuán)，例如杏仁核和海馬中，接受神經(jīng)纖維的投射，并已被證明其在復(fù)雜的情緒調(diào)節(jié)中起重要作用[10-11]。在情緒應(yīng)激的環(huán)境下，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)被認(rèn)為是導(dǎo)致循環(huán)糖皮質(zhì)激素升高和自主神經(jīng)活動增加的主要神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，并在心血管應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[12]。下丘腦中主要的與情緒相關(guān)的子核團(tuán)包括下丘腦腹內(nèi)側(cè)[11]、弓狀核[13]和下丘腦背內(nèi)側(cè)核[14]。VMH是大腦中涉及情緒網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)相關(guān)腦區(qū)，且有研究表明VMH活性的改變在調(diào)節(jié)機(jī)體的血壓和心率上有一定的作用[15]，VMH活性變化也與機(jī)體自主神經(jīng)系統(tǒng)的活性改變密切相關(guān)。研究表明，電刺激VMH會增加外周交感神經(jīng)活性，而直接損毀VMH則會增加外周副交感神經(jīng)活性[12]。Lin等[9]用光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)的方法，通過改變核團(tuán)活性來改變小鼠的行為，從而證實(shí)位于VMH內(nèi)的子核團(tuán)VMHVL是介導(dǎo)攻擊行為和憤怒情緒的關(guān)鍵核團(tuán)。由此可見，中樞情緒核團(tuán)的激活與外周自主神經(jīng)系統(tǒng)活性是密切相關(guān)的。

注：圖A為兩組大鼠二維超聲心動圖對比；圖B為經(jīng)二維超聲心動圖檢查所得各項(xiàng)心臟指標(biāo)。***表示P<0.005，**表示P<0.01，****表示P<0.001。圖2 VMHVL激活對心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

在此基礎(chǔ)上，本研究采用化學(xué)遺傳方法中僅由定制藥物激活的定制受體(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs)來特異性激活VMHVL。DREADDs可通過惰性藥物(如小分子)激活，以對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、神經(jīng)元活動和行為進(jìn)行長時(shí)程的調(diào)控[16-17]。通過定向分子轉(zhuǎn)化的過程，創(chuàng)建人突變型毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M1、M2、M3、M4和M5型)，該類受體對內(nèi)源性配體乙酰膽堿無效，卻能被CNO激活[10]。選取激活型受體hM3D(Gq)，其激活將觸發(fā)細(xì)胞膜Ca2+的內(nèi)流產(chǎn)生膜電位，從而誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)沖動，該效應(yīng)會持續(xù)至結(jié)合的CNO被機(jī)體完全代謝消除。目前評價(jià)DREADD效應(yīng)的指標(biāo)主要有四種(前兩種為最常用的方法)：(1)急性離體腦切片電生理學(xué)檢測[18]；(2)神經(jīng)元活性相關(guān)的蛋白C-FOS含量[19]；(3)在體多通道微電極陣列神經(jīng)信號技術(shù)檢測神經(jīng)元活性；(4)基于鈣成像技術(shù)的神經(jīng)元活性檢測[20]。本研究選擇C-FOS熒光染色作為判斷神經(jīng)元激活的指標(biāo)[21]。此外，腺病毒通常用作目的基因傳遞載體，用來在目標(biāo)神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)受體的高水平表達(dá)[16]。目前化學(xué)遺傳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，并成為鑒定神經(jīng)回路結(jié)構(gòu)和功能的重要工具，用以特異性激活或抑制特定的中樞腦區(qū)[22]。在本研究中，利用化學(xué)遺傳技術(shù)成功將hM3D(Gq)受體表達(dá)在VMHVL神經(jīng)元上，并通過腹腔注射CNO，激活VMHVL神經(jīng)元細(xì)胞膜上的hM3D(Gq)受體。有實(shí)驗(yàn)熒光結(jié)果顯示，激活組VMHVL較對照組有更多的C-FOS表達(dá)，提示VMHVL神經(jīng)元被成功激活。

在外周，自主神經(jīng)系統(tǒng)在心血管功能的調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，機(jī)體交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)的活性處于動態(tài)平衡，而絕大部分心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展都與交感神經(jīng)的過度激活有關(guān)[23]。從大腦皮層到脊髓的各級神經(jīng)系統(tǒng)，也分布著調(diào)節(jié)心臟活動的中樞。在大腦中，下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)已被證明是整個(gè)交感神經(jīng)活性和調(diào)節(jié)心血管功能的中心環(huán)節(jié)，而PVN功能的激活可增加心臟交感神經(jīng)活性并加重心臟功能障礙和結(jié)構(gòu)重構(gòu)[24]。最近的研究表明，PVN與VMHVL之間存在神經(jīng)纖維的雙向投射，即二者之間存在結(jié)構(gòu)與功能的連接[25]。在本研究中，成功激活心肌梗死后大鼠的VMHVL兩周，超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠心臟功能在VMHVL激活后明顯惡化，結(jié)構(gòu)改變也較對照組明顯。這提示，VMHVL的激活可能會通過激活PVN，提高機(jī)體的交感神經(jīng)活性，打破交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)的動態(tài)平衡，從而影響外周心臟的功能障礙和結(jié)構(gòu)改變。值得一提的是，VMHVL與心臟之間相互影響的自主神經(jīng)通路需進(jìn)一步的研究和探索。血清NE的結(jié)果提示，化學(xué)遺傳激活VMHVL神經(jīng)元確實(shí)引起外周交感神經(jīng)指標(biāo)的升高，提示一定程度的交感神經(jīng)激活作用。

由此可見，機(jī)體的情緒應(yīng)激對心肌梗死后心臟功能變化有著重要影響。本研究將中樞情緒腦區(qū)與外周器官的功能變化相聯(lián)系，通過干預(yù)核團(tuán)活性從而對外周心血管系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示VMHVL介導(dǎo)的慢性情緒應(yīng)激可惡化心肌梗死后心臟功能。未來需進(jìn)一步研究VMHVL情緒核團(tuán)激活影響心臟的具體神經(jīng)通路，并探索其潛在的分子機(jī)制，可在臨床上為心肌梗死患者精準(zhǔn)調(diào)控情緒，進(jìn)一步改善心肌梗死后心功能的恢復(fù)，提供新思路和新的治療方案，也為心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)及情緒易激動的患者提供新穎的心血管疾病預(yù)防策略。