古興旺 周帆 穆軍升

(1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京100069； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心超聲科，北京100039； 3.北京市安貞醫(yī)院心外科，北京100029)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)發(fā)生后，梗死的心肌將逐漸由纖維組織代替，并永久地造成心功能下降，而干細(xì)胞由于其多向分化潛能，在組織修復(fù)重生方面有著巨大的潛能。因此，將干細(xì)胞療法應(yīng)用于MI來逆轉(zhuǎn)下降的心功能，是一條前景可觀的思路。早期嘗試直接心肌內(nèi)和靜脈內(nèi)注射干細(xì)胞等方式有一定療效[1-2]，但其弊端在于過低的干細(xì)胞生存率[3]和心肌組織處的低停留率[4]，所以借用心肌補片等心臟組織工程技術(shù)[5]，并結(jié)合一些方式促進(jìn)其預(yù)先向心肌細(xì)胞分化，可在一定程度上應(yīng)對這些問題。在這方面，一般選擇全能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和脂肪干細(xì)胞(adipose stem cell，ASCs)等。而由于應(yīng)用ESCs存在的倫理和免疫排斥問題[6-7]，研究方向已轉(zhuǎn)向以多能干細(xì)胞為主[8-10]，其中，ASCs分化為心肌細(xì)胞的潛能可能要高于BMMSCs[11]。既往已有多種方法可促進(jìn)干細(xì)胞分化為有功能的心肌樣細(xì)胞，即干細(xì)胞衍生心肌樣細(xì)胞(stem cell-derived cardiomyocytes，SCCMs)，然而研究表明，此種心肌細(xì)胞主要為幼稚型，其在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面類似于原生心肌細(xì)胞發(fā)育的早期階段[12]，很難進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療MI等疾病。因此，如何提高其成熟度來達(dá)到臨床應(yīng)用的要求便成了目前亟待解決的問題。在目前被探索的多種方法中，機(jī)械牽張作為心肌細(xì)胞受到的主要機(jī)械刺激之一，被認(rèn)為在這方面具有較大的潛能，但以往尚無對機(jī)械牽張研究的單獨梳理，現(xiàn)從機(jī)械牽張的參數(shù)、機(jī)械牽張對SC-CMs成熟的影響和可能存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等方面對相關(guān)研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 促進(jìn)SC-MCs成熟的機(jī)械牽張參數(shù)

體內(nèi)搏動的心臟不斷受到回心血流充盈心腔所致的前負(fù)荷和心臟射血時主要來自主動脈壓的后負(fù)荷，機(jī)械牽張主要通過模擬正常心肌細(xì)胞受到的前負(fù)荷來促進(jìn)SC-CMs的進(jìn)一步成熟。牽張的施加方式多種多樣，最主要的原理是將工程化組織兩端分別固定在機(jī)械臂上，由一端可移動的機(jī)械臂控制牽張的幅度和頻率，也有基于磁力和氣壓控制等的牽張力施加設(shè)備[13-14]，由于種類和型號繁多且均能按設(shè)定的參數(shù)施加牽張力，也無不同設(shè)備間區(qū)別的相關(guān)研究，現(xiàn)不展開討論。牽張刺激的參數(shù)可分為牽張軸向、牽張幅度(以細(xì)胞被拉長的比例計算)、牽張頻率和牽張時間等。在牽張軸向上，盡管在研究機(jī)械牽張促進(jìn)干細(xì)胞分化為SC-CMs時還有雙軸、多軸和等軸等多種方式[15-17]，但在促進(jìn)SC-CMs進(jìn)一步成熟時，單軸牽張仍是更主流的選擇[14，18-19]，且少有研究去探索軸向區(qū)別所造成的影響。牽張幅度方面，雖然Gir?o-Silva等[16]發(fā)現(xiàn)12%拉伸度未能誘導(dǎo)人ASCs中心血管標(biāo)志物的表達(dá)，間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD29和CD90)也保持不變，但他們說明以前有實驗證明10%甚至以上的牽張幅度可促進(jìn)ASCs向心肌分化；其他眾多學(xué)者的研究表明，10%左右的牽拉程度可促進(jìn)SC-CMs在心肌標(biāo)志物和肌節(jié)發(fā)育等方面的成熟[13，15，17，20-21]，Huang等[22]通過對照實驗發(fā)現(xiàn)10%可能為最佳的牽張幅度，這可能與其接近生理狀態(tài)有關(guān)。在牽張頻率方面，Zhang等[21]和Ruan等[23]通過靜態(tài)(0 Hz)和循環(huán)(非0 Hz)牽張的對照實驗，肯定了后者的效果。為模擬正常的心臟搏動，循環(huán)牽張的頻率基本被選定為1 Hz，Huang等[22]進(jìn)一步指出1 Hz或1.5 Hz的循環(huán)牽張可誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞相關(guān)基因，且1 Hz可能最為合適。另外，Morgan等[24]發(fā)現(xiàn)相比固定的頻率(1 Hz)，動態(tài)變化的牽張頻率對新生小鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞間偶連有所影響，但收縮功能在兩組間無明顯區(qū)別。牽張時間在大多數(shù)實驗中為1～7 d，也有學(xué)者將其細(xì)分至每天有固定的拉伸時間(如0.5 h/d)[19，25]，但和牽張軸向一樣，其和施加全天候牽張力的區(qū)別并未被研究。綜上所述，一組參數(shù)為10%、1 Hz和1～7 d(全天候)的單軸機(jī)械牽張可被視作較為通用的選擇。

2 機(jī)械牽張對SC-CMs成熟的影響

現(xiàn)今，研究者們已探尋出許多可促進(jìn)SC-CMs分化成熟的策略，如長程培養(yǎng)、共培養(yǎng)、3D培養(yǎng)和電學(xué)刺激等，機(jī)械刺激也是其中重要的一員，主要包括流體剪切力和機(jī)械牽張等[26]。機(jī)械牽張(模擬前負(fù)荷)作為心臟組織接受的主要機(jī)械刺激之一，已被多個研究證明可有效促進(jìn)SC-CMs的發(fā)育和成熟。以下將從結(jié)構(gòu)和功能兩個層面探討機(jī)械牽張的影響。

2.1 結(jié)構(gòu)層面

大量研究表明，牽張刺激可從細(xì)胞排列、細(xì)胞形態(tài)和肌節(jié)發(fā)育等方面誘導(dǎo)SC-MCs的分化成熟。Ruan等[8]的實驗表明，經(jīng)過2周的靜態(tài)牽張培養(yǎng)，組織中的細(xì)胞相比無刺激組均表現(xiàn)出更高的有序性，基質(zhì)膠原纖維的排列也更加規(guī)則；Tulloch等[27]則深入地以對準(zhǔn)值為指標(biāo)，定量分析循環(huán)牽張對誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞(iPSC-CMs)和胚胎干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞(ESC-CMs)組織中細(xì)胞排列的影響，與無張力組相比，持續(xù)的靜態(tài)牽張培養(yǎng)和按一定頻率施加張力的循環(huán)牽張培養(yǎng)都成倍增加細(xì)胞排列的有序性。有趣的是，機(jī)械牽張能引起人ESC-CMs和人心房成纖維細(xì)胞在垂直于牽張方向上重新排列[28-29]，而另有實驗發(fā)現(xiàn)對于新生小鼠心肌細(xì)胞，其作用結(jié)果卻是平行[30]。此外，在Abilez等[10]的長程培養(yǎng)中，施加牽張的人iPSC-CMs在培養(yǎng)至25～28 d時表現(xiàn)出異質(zhì)的細(xì)胞表型，其中心室肌樣細(xì)胞占比超過50%。對于肌節(jié)的發(fā)育，多數(shù)研究結(jié)果表明牽張刺激可促進(jìn)工程組織中細(xì)胞的成熟，如更長的長度，更清晰整齊的橫紋等[31-34]；Kroll等[9]設(shè)計了一種能對培養(yǎng)在聚二甲基硅氧烷薄膜上的單層人iPSC-CMs同時施加電學(xué)和機(jī)械刺激的設(shè)備，施加機(jī)械牽張的組別中肌節(jié)長度卻明顯縮短，推測這也許和其二維培養(yǎng)環(huán)境或施加牽張力前的其他環(huán)節(jié)有關(guān)。

微觀表現(xiàn)上，機(jī)械牽張可有效促進(jìn)SC-CMs心肌標(biāo)志物的表達(dá)(包括RNA和蛋白質(zhì)含量)。在眾多實驗[11，20，27，30，32，35-36]中，肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、α-肌動蛋白、N-鈣黏蛋白、連接蛋白43、轉(zhuǎn)錄因子GATA4、轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、心房鈉尿肽和腦鈉肽等重要心肌標(biāo)志物均可被牽張刺激誘導(dǎo)表達(dá)，這些蛋白質(zhì)對干細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育具有重要作用；另外一個指標(biāo)是β-肌球蛋白重鏈/α-肌球蛋白重鏈(β-MHC/α-MHC)的比值，其值的升高與心肌細(xì)胞的成熟相關(guān)[37]，在相應(yīng)的研究中，α-MHC的含量不一定會下降，但β-MHC的表達(dá)量一般會被上調(diào)，且可高達(dá)800%[23，32]。

2.2 功能層面

在評價體外心肌細(xì)胞的功能時，收縮能力和收縮頻率是主要指標(biāo)，在許多實驗中，細(xì)胞對心血管藥物的反應(yīng)性和鈣流動力學(xué)表現(xiàn)也是重要的指標(biāo)。研究表明，機(jī)械牽張能顯著提升心肌樣組織的主動收縮力[21]，其收縮力-前負(fù)荷關(guān)系也在合適的牽拉范圍內(nèi)符合Frank-Starling定律，且循環(huán)牽張相比靜態(tài)牽張對曲線斜率的提升更加顯著[23]，但機(jī)械牽張對細(xì)胞自主收縮頻率的影響尚無定論[10，32]。對于一些藥物如異丙腎上腺素和利多卡因，給予牽張培養(yǎng)的細(xì)胞能對其作出類似原生心肌細(xì)胞的反應(yīng)，表現(xiàn)為收縮力相應(yīng)的增強(qiáng)[38-39]。這些提升可能得益于胞內(nèi)肌節(jié)的發(fā)育以及組織的整齊排列等[30]。在鈣流動力學(xué)方面[9-10，23，32]，較為一致的觀念是牽張刺激可明顯提升鈣瞬變峰值，這也印證了其提升細(xì)胞收縮力的作用。另外，通過進(jìn)一步測量組織的收縮力-頻率曲線(評價心肌興奮收縮偶聯(lián)的一個良好指標(biāo))，發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張有助于減弱細(xì)胞原本的負(fù)相關(guān)關(guān)系，向著正常心肌的正相關(guān)關(guān)系發(fā)展[8]。但在是否可縮短達(dá)峰時間、50%復(fù)極時間等問題上，目前仍有爭議。

對于MI的治療，培養(yǎng)心肌樣細(xì)胞的目的是保證其在植入受損心臟后能起到足夠的治療作用，達(dá)到盡可能恢復(fù)患者心功能的目的。從這個角度說，實驗室中評價SC-CMs是否心肌向分化成熟的最終方式應(yīng)該是體內(nèi)試驗，而目前相關(guān)的研究并不多。在Mihic等[32]的MI小鼠模型實驗中，雖然有無事先經(jīng)受牽張刺激不會影響其心電圖表現(xiàn)，但2D超聲心動圖顯示牽張組的心室前壁厚度明顯增厚，對處死小鼠進(jìn)行尸檢也可觀察到該組的工程組織與小鼠心臟擁有更好的嵌合度。Abd等[15]發(fā)現(xiàn)向兔MI區(qū)域注入干細(xì)胞并養(yǎng)育8周后，與未經(jīng)過牽拉刺激的干細(xì)胞組相比，受牽拉組的左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率均明顯改善，定量分析也顯示受牽拉組的MI面積明顯減小。這些實驗一定程度上說明對干細(xì)胞進(jìn)行移植前牽張刺激對于恢復(fù)受損心臟結(jié)構(gòu)和功能的積極影響，但仍需更多的研究證明其真實性和重要性。

3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

如前所述，目前的研究大多停留在探究機(jī)械牽張的影響上，內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不明確，有如下兩條研究進(jìn)展較大。(1)TRPV4/PI3K/Akt信號通路。TRPV4通道是允許Ca2+通過的非選擇性陽離子通道，其活動導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+升高，研究證明，單軸循環(huán)牽張能激活TRPV4通道引起Ca2+內(nèi)流，并激活經(jīng)典的調(diào)控多種細(xì)胞生命活動的PI3K/Akt信號通路，最終導(dǎo)致人ESC-CMs在垂直于牽張方向上的重排[29]。類似的，也有研究者發(fā)現(xiàn)對于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，機(jī)械牽張可通過TRPV4通道促進(jìn)其重排，進(jìn)一步驗證了該通道的作用[40]。深入的實驗表明，激活TRPV4通道引起的Ca2+內(nèi)流只占牽張刺激引起的一部分，也就是說在牽張刺激和Ca2+內(nèi)流之間，還有其他機(jī)制起著作用，如TRPV2通道[29]。(2)(miR-27a)/SCF通路。miR-27a參與調(diào)控細(xì)胞的多態(tài)性、腫瘤發(fā)生、增殖和凋亡等病理生理過程。Cao等[17]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BMMSCs被施加循環(huán)牽張刺激時，miR-27a的表達(dá)有所降低，而過表達(dá)它則會下調(diào)GATA4、TNNT2、MEF-2C和連接蛋白43等心臟標(biāo)志物的表達(dá)，這意味著miR-27a在機(jī)械牽張的條件下抑制了BMMSCs的心肌向分化；同時，作者通過一系列步驟證明SCF基因是miR-27a的作用靶點，轉(zhuǎn)染SCF基因表達(dá)的siRNA可下調(diào)心肌標(biāo)志物的表達(dá)，且同時轉(zhuǎn)染這些siRNA和miR-27則會進(jìn)一步增加下調(diào)的幅度。這些結(jié)果綜合說明(miR-27a)/SCF通路在調(diào)控機(jī)械牽張對SC-CMs分化成熟的影響，但詳細(xì)的內(nèi)容仍需更多的研究加以闡述。

4 問題和展望

綜上所述，機(jī)械牽張確實可在細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等方面促進(jìn)SC-CMs的成熟。但這方面研究存在的一個問題是研究的多樣性，差異巨大的研究設(shè)計和設(shè)備使不同研究之間的可比性很差，相應(yīng)的，在開發(fā)出能滿足大多數(shù)學(xué)者要求的通用牽張施加設(shè)備和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境上仍需更多研究和努力。此外，大多數(shù)研究的對照組僅設(shè)置在了是否施加機(jī)械牽張以探究其對SC-CMs成熟的影響，卻缺乏這些細(xì)胞與原生心肌細(xì)胞的對比，因而無從得知這些衍生心肌細(xì)胞的實際分化成熟度，不利于其臨床應(yīng)用。事實上，即便機(jī)械牽張能有效促進(jìn)SC-CMs的成熟，這種程度也遠(yuǎn)不及原生心肌細(xì)胞[27]，這也不難理解，成熟的心肌細(xì)胞是在復(fù)雜的生理環(huán)境下接受各種刺激并經(jīng)過長時間的生長發(fā)育而來的，從理論上來說，單獨模擬生理條件的牽張刺激自然很難在幾天內(nèi)讓SC-CMs接近前者的分化程度。因此，內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制作為重要的啟發(fā)和推進(jìn)動力就顯得格外重要，但目前也少被深入研究，且體內(nèi)試驗也屈指可數(shù)，更不用說進(jìn)一步應(yīng)用于臨床。種種跡象均表明這方面的研究尚未成熟。結(jié)合目前的研究狀況，未來研究需重點突破低促成熟效率和低分子機(jī)制認(rèn)知程度，在充分認(rèn)識內(nèi)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用不同的策略，也許有助于盡早達(dá)到理想的效果。