劉鐘澤，孫穎郁，張信文，楊思遠(yuǎn)

（1.熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158；2.海南科技職業(yè)大學(xué)，海南 海口 571126；3.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875）

自然界中許多動(dòng)物可以通過(guò)聲音進(jìn)行交流，例如鯨，蝙蝠等[1]，但這些發(fā)聲行為并不是通過(guò)學(xué)習(xí)產(chǎn)生的。鳴禽是除了人類以外極少具有發(fā)聲學(xué)習(xí)能力的動(dòng)物，鳥(niǎo)類具有鳴叫（call）和鳴唱（sing）兩種發(fā)聲行為，其叫聲中包含有豐富的生物學(xué)信息，被用來(lái)進(jìn)行個(gè)體及種群之間的識(shí)別、求偶、覓食、報(bào)警、筑巢等活動(dòng)，被稱為鳥(niǎo)類的語(yǔ)言[2]。與人類的語(yǔ)言相似，鳴禽的鳴唱是一種依賴于聽(tīng)覺(jué)反饋的后天習(xí)得發(fā)聲行為。幼鳥(niǎo)如果錯(cuò)過(guò)了學(xué)習(xí)鳴唱的特定時(shí)期，成年之后可能出現(xiàn)鳴唱障礙，成年雄鳥(niǎo)仍需聽(tīng)覺(jué)反饋維持其結(jié)晶化鳴唱。所以，鳴禽作為研究感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)信息整合的模型，其鳴唱行為的學(xué)習(xí)過(guò)程和神經(jīng)控制機(jī)制與人類具有相似性[3]，研究鳴禽發(fā)聲控制中樞可塑性對(duì)于揭示人類語(yǔ)言學(xué)習(xí)的神經(jīng)機(jī)制具有重要意義。

斑胸草雀（Taeniopygia guttata）作為模式動(dòng)物，被廣泛用于習(xí)得發(fā)聲行為的研究，其鳴唱系統(tǒng)是由腦中一系列不同水平、界限清楚且離散分布的特定核團(tuán)構(gòu)成的神經(jīng)通路[4]。發(fā)聲運(yùn)動(dòng)通路（Vocal Motor Pathway，VMP）由端腦的高級(jí)發(fā)聲中樞（High Vocal Control Center，HVC）投射神經(jīng)纖維下行經(jīng)過(guò)古紋狀體櫟核（Robustus Archistriatalis，RA）最后投射到延髓，通過(guò)低位運(yùn)動(dòng)中樞舌下神經(jīng)核鳴管支nXIIts核團(tuán)支配鳴肌從而控制發(fā)聲。發(fā)聲學(xué)習(xí)通路（Anterior Forebrain Pathway，AFP）是從HVC投射神經(jīng)纖維經(jīng)過(guò)前腦X區(qū)（Area X）、丘腦背外側(cè)核內(nèi)側(cè)部DLM（Medial portion of the dorsolateral nucleus of the anterior thalamus）、新紋狀體前部巨細(xì)胞核外側(cè)部（Lateral portion of the Magnocellular nucleus of the Anterior NeostriatumLMAN），最后至RA 形成的環(huán)路，主要參與鳴唱可塑性[5-9]。

LMAN核團(tuán)是AFP通路的最后一個(gè)輸出核團(tuán)，很可能與鳴唱的學(xué)習(xí)和鳴曲可塑性有關(guān)[10]。幼年時(shí)期損毀LMAN核團(tuán)會(huì)使鳴唱提前穩(wěn)定（Crystallization），從而阻斷鳴唱學(xué)習(xí)[11]。成年時(shí)期損毀LMAN核團(tuán)短期內(nèi)幾乎不影響其鳴曲結(jié)構(gòu)，但在致聾前損毀LMAN核團(tuán)，可以有效阻止鳴唱的退化[12]。然而在成年致聾斑胸草雀的鳴唱退化過(guò)程中，致聾對(duì)LMAN的影響和LMAN核團(tuán)的工作機(jī)制仍不完全清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)成年雄性斑胸草雀進(jìn)行聽(tīng)覺(jué)剝奪，檢測(cè)鳴禽鳴唱行為以及腦內(nèi)LMAN核團(tuán)的變化，探究LMAN核團(tuán)在鳴禽發(fā)聲系統(tǒng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇8只鳴唱較好的成年雄性斑胸草雀（＞90 PHD）為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，4只為對(duì)照組，4只為致聾組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用符合國(guó)家和學(xué)校動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定并遵守國(guó)際慣例。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)育在同一環(huán)境，并保持致聾組手術(shù)后14 d內(nèi)連續(xù)錄音。

0.96%戊巴比妥鈉，20%氨基甲酸乙酯，4%多聚甲醛（PFA），NaCl，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（PB，pH 7.4），無(wú)水乙醇，二甲苯，0.1%焦油紫染液，Enpon812中性樹(shù)膠等均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器

電子天平，Sartorius AL104；低溫恒冷切片機(jī)，Leica CM1850；體視鏡及冷光源，北京市科儀電光儀器廠XTT-AB；錄音聲卡，F(xiàn)ocusrite Scarlett 2i4；恒流泵，保定蘭格恒流原有限公司，BT50-1J；光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)，Olympus CX31；倒置熒光顯微鏡，Zeiss ObserverZ1。

1.2 方法

1.2.1 聽(tīng)覺(jué)剝奪手術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷水?dāng)嗍? h后，胸大肌注射戊巴比妥鈉（0.5 g/kg）進(jìn)行麻醉，剝離雙側(cè)耳蝸致聾，在顯微鏡下觀察剝離的雙側(cè)耳蝸是否完整。對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)，采用與致聾組相同的麻醉過(guò)程，也將表面皮膚剪開(kāi)，但不將鼓膜捅破，也不將耳蝸拔除，進(jìn)行假手術(shù)的目的是為了避免手術(shù)本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。術(shù)后確保手術(shù)鳥(niǎo)處在清潔和溫暖的環(huán)境中，供給足夠的食物和清水，對(duì)照組與致聾組手術(shù)后在同一環(huán)境連續(xù)養(yǎng)育14 d。

1.2.2 灌流與切片

致聾組與對(duì)照組手術(shù)后在同一環(huán)境連續(xù)養(yǎng)育14 d后，胸大肌注射氨基甲酸乙酯（2.5 g/kg）進(jìn)行麻醉，使用恒流泵以22 rpm流速向左心室中泵入4%多聚甲醛溶液固定5 min，隨后剪下頭部，剝離全腦并將其置于4%多聚甲醛溶液中固定6 h，再轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中4 ℃過(guò)夜至腦沉底。利用低溫恒冷切片機(jī)冠狀切片，片厚為10 μm，平行取6套（平行切取6片后舍棄6片，再平行切取6片），-20 ℃保存。

1.2.3 焦油紫染色

設(shè)計(jì)意圖：通過(guò)討論與交流，學(xué)生逐漸形成基于事實(shí)證據(jù)，分析生物規(guī)律，理解生命本質(zhì)的科學(xué)思維。教師充分利用實(shí)驗(yàn)資料，在學(xué)生原有認(rèn)知上挖掘深層知識(shí)，初步滲透科學(xué)探究的方法教育。

上述切片在0.1%焦油紫染液中孵育7 min后，在70%乙醇中浸泡3 min。接著用95%乙醇浸泡兩次，每次1 min。然后用100%乙醇浸泡三次，每次1 min。最后用二甲苯處理兩次，每次5 min，中性樹(shù)膠封片。

1.2.4 NeuN免疫組織化學(xué)標(biāo)記

將1.2.2節(jié)得到的切片在0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。然后在3%正常羊血清（0.5%TritonX-100/PBS 稀釋，ZLI-9021，Jackson）室溫封閉30 min；最后用一抗小鼠抗NeuN 抗體（1∶400，MAB377，Millipore），4 ℃孵育過(guò)夜。次日將切片在室溫中再孵育2 h；用0.01 mol/L PBS 漂洗3 次，每次5 min；然后用二抗Alexa fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶200，A11005，Invitrogen）在室溫孵育2 h；最后用0.01 mol/L PBS漂洗5次，每次5 min；用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.5 聲譜分析

雄性斑胸草雀的鳴曲由重復(fù)出現(xiàn)的短語(yǔ)組成，每個(gè)短語(yǔ)包含多個(gè)按照一定順序排列的音節(jié)。使用Sound Analysis Pro（SAP 2011）軟件錄制和分析斑胸草雀的鳴曲。手術(shù)前后，選取鳴曲中同一個(gè)短語(yǔ)作為檢測(cè)對(duì)象，每只動(dòng)物統(tǒng)計(jì)處死當(dāng)天和手術(shù)前兩天的鳴曲，每天統(tǒng)計(jì)30 個(gè)該重復(fù)短語(yǔ)，分析每個(gè)音節(jié)平均熵值（Mean Entropy）和熵值變異數(shù)（Entopy Variance）等參數(shù)。

1.2.6 核團(tuán)面積和體積分析

采用Olympus顯微鏡觀察經(jīng)焦油紫染色的雄性斑胸草雀腦切片并采集LMAN核團(tuán)圖像。LMAN核團(tuán)的邊界在4倍物鏡下清晰可見(jiàn)，用ImageJ 12.0軟件統(tǒng)計(jì)核團(tuán)面積。LMAN 核團(tuán)體積用切片上LMAN 核團(tuán)的平均面積與切片數(shù)的乘積表示[13]，即V = S·N·h，其中，V為L(zhǎng)MAN核團(tuán)的體積（mm3）；S為切片上LMAN核團(tuán)的平均面積（mm2）；h為一套切片上相鄰腦片間的距離（120 μm）；N為一套切片上含有LMAN核團(tuán)的腦片總數(shù)。

1.2.7 核團(tuán)神經(jīng)元面密度分析

采用Zeiss 倒置熒光顯微鏡對(duì)經(jīng)NeuN 免疫組織化學(xué)標(biāo)記的雄性斑胸草雀腦切片進(jìn)行拼圖拍照，采集LMAN核團(tuán)圖像。LMAN核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)元在20倍物鏡下清晰可見(jiàn)，用Adobe Photoshop軟件對(duì)核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)元進(jìn)行3個(gè)100 μm×100 μm視野的取樣統(tǒng)計(jì)，獲得NeuN免疫組織化學(xué)標(biāo)記下LMAN核團(tuán)神經(jīng)元面密度的數(shù)據(jù)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 12.0（SPSS，Chicago，IL）和Graphpad prism 5.0（Graphpad Software，San Diego，CA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析致聾前后鳴唱音節(jié)參數(shù)、LMAN核團(tuán)平均面積和體積以及神經(jīng)元面密度的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 聽(tīng)覺(jué)剝奪引起成年雄性斑胸草雀鳴唱行為的退化

聲譜分析結(jié)果（見(jiàn)圖1）顯示，對(duì)照組動(dòng)物手術(shù)前后音節(jié)結(jié)構(gòu)保持不變（左列），而致聾組動(dòng)物手術(shù)前后短語(yǔ)和音節(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化（右列），鳴曲聲譜結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著畸變和短語(yǔ)丟失。

2.2 聽(tīng)覺(jué)剝奪前后成年雄性斑胸草雀音節(jié)參數(shù)的變化

為了檢測(cè)致聾對(duì)鳴唱行為的影響，本研究分析了致聾前后音節(jié)平均熵值和熵值變異數(shù)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，致聾組手術(shù)后14 d 音節(jié)平均熵值與基線的百分比顯著減?。≒ ＜0.05）（對(duì)照組為104.39±1.91%，致聾組為94.49±3.14%），熵值變異數(shù)與基線的百分比顯著減?。≒ ＜0.05）（對(duì)照組為88.63±3.94%，致聾組為75.03±2.98%）。

2.3 聽(tīng)覺(jué)剝奪誘導(dǎo)成年雄性斑胸草雀LMAN核團(tuán)平均面積和體積的變化

圖1 對(duì)照組和致聾組實(shí)驗(yàn)鳥(niǎo)手術(shù)前后鳴曲聲譜結(jié)構(gòu)的變化Figure 1 Changes of the sonographic structure of song in control group and deafening group before and after surgery

圖2 致聾前后熵值和熵值變異數(shù)的定量分析Figure 2 Quantitative analysis of entropy and entropy variance before and after deafness

焦油紫染色結(jié)果顯示，LMAN核團(tuán)染色較深，邊界清晰，胞體清晰可見(jiàn)，多為梭形、多角形或橢圓形，如圖3 所示。圖4（A）可以看出，對(duì)照組LMAN 核團(tuán)的平均面積為（0.0681±0.0012）mm2，致聾組LMAN 核團(tuán)的平均面積為（0.0621±0.0011）mm2，顯示致聾組切片上LMAN核團(tuán)的平均面積有明顯減小的趨勢(shì)（與對(duì)照組相比），數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異（P ＜0.05）。LMAN核團(tuán)體積在致聾前后的變化如圖4（B）所示，對(duì)照組LMAN核團(tuán)體積為（0.0629±0.0011）mm3，致聾組LMAN核團(tuán)體積為（0.0549±0.0014）mm3，表明致聾組LMAN核團(tuán)的體積與對(duì)照組相比也存在明顯減小的趨勢(shì)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖3 聽(tīng)覺(jué)剝奪對(duì)LMAN核團(tuán)橫截面積的影響Figure 3 Effects of auditory deprivation on the cross-sectional area of the LMAN nucleus

2.4 聽(tīng)覺(jué)剝奪誘導(dǎo)成年雄性斑胸草雀LMAN核團(tuán)神經(jīng)元面密度的變化

圖4 致聾前后LMAN核團(tuán)平均面積和體積的比較Figure 4 Comparison of the mean area and volume of LMAN nuclei before and after deafness

NeuN免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果顯示，LMAN核團(tuán)染色特異性較低，邊界不清晰，因此使用Adobe Photoshop軟件對(duì)LMAN 核團(tuán)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行100 μm × 100 μm 3 個(gè)視野的取樣統(tǒng)計(jì)，獲得NeuN 免疫組織化學(xué)標(biāo)記下LMAN核團(tuán)內(nèi)細(xì)胞面密度的數(shù)據(jù)，可以看到在100 μm×100 μm的取樣統(tǒng)計(jì)視野中，LMAN核團(tuán)內(nèi)細(xì)胞的胞體清晰可見(jiàn)，便于統(tǒng)計(jì)，如圖5所示。應(yīng)用SPSS 12.0（SPSS，Chicago，IL）和Graphpad prism5.0（Graphpad Software，San Diego，CA）軟件對(duì)LMAN 核團(tuán)內(nèi)細(xì)胞面密度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果（見(jiàn)圖6）顯示，對(duì)照組LMAN 核團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞面密度為（16.24±0.18）個(gè)/0.01 mm2，致聾組LMAN 核團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞面密度為（12.18±0.16）個(gè)/0.01 mm2，致聾前后LMAN核團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞面密度存在差異。與對(duì)照組相比，致聾組LMAN核團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞面密度明顯較小，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異（P ＜0.05）。

圖5 聽(tīng)覺(jué)剝奪對(duì)LMAN核團(tuán)內(nèi)細(xì)胞面密度的影響Figure 5 Effects of auditory deprivation on the cellular surface density in LMAN nuclei

圖6 致聾組與對(duì)照組LMAN核團(tuán)內(nèi)細(xì)胞面密度的比較Figure 6 Comparison of cellular surface density before and after deafness in LMAN nuclei

3 討論

已有學(xué)者研究表明，幼年斑胸草雀在受到噪音等異常的聽(tīng)覺(jué)干擾時(shí)，鳴曲結(jié)構(gòu)（syllable structure）或序列（syllable sequence）會(huì)發(fā)生明顯的變化，但這些變化是可逆的，去除異常噪音反饋后鳴曲的音節(jié)結(jié)構(gòu)或音節(jié)序列可恢復(fù)到正常水平[14]，聽(tīng)覺(jué)反饋在鳴曲產(chǎn)生和學(xué)習(xí)過(guò)程發(fā)揮主要作用。本實(shí)驗(yàn)中，成年雄性斑胸草雀在聽(tīng)覺(jué)剝奪手術(shù)后14 d，鳴唱行為發(fā)生了顯著的變化，音節(jié)參數(shù)方面主要表現(xiàn)為熵值和熵值變異數(shù)與基線的百分比明顯減小。熵是熱力學(xué)中表征物質(zhì)狀態(tài)的參量之一，因此熵值是衡量鳴曲結(jié)構(gòu)混亂程度的重要音節(jié)參數(shù)。致聾14 d后熵值顯著增大[8]，說(shuō)明聽(tīng)覺(jué)剝奪能夠誘導(dǎo)成年雄性斑胸草雀的鳴曲趨向于更加混亂和不穩(wěn)定，造成已結(jié)晶化的鳴曲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的退化，表明即使是臨界型鳴禽，成年后穩(wěn)定的鳴曲也仍需要聽(tīng)覺(jué)反饋來(lái)維持，一旦失去聽(tīng)覺(jué)反饋，鳴禽就無(wú)法修正和匹配自身鳴曲，進(jìn)而造成鳴唱行為的退化，導(dǎo)致致聾鳥(niǎo)變成為聾啞鳥(niǎo)，提示聽(tīng)覺(jué)反饋在維持鳴曲的復(fù)雜性中發(fā)揮重要的功能。

鳴禽鳴唱學(xué)習(xí)的神經(jīng)基礎(chǔ)是腦內(nèi)的鳴唱控制系統(tǒng)，前人研究認(rèn)為VMP通路在鳴禽學(xué)習(xí)過(guò)程中對(duì)鳴曲的穩(wěn)定性具有重要作用[6，9]。本實(shí)驗(yàn)初步統(tǒng)計(jì)與分析致聾14 d后LMAN核團(tuán)的平均面積和體積有明顯減小的趨勢(shì)，LMAN核團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞面密度下降，說(shuō)明了致聾導(dǎo)致的成年雄性斑胸草雀鳴唱行為的畸變，可能與致聾所導(dǎo)致其腦內(nèi)發(fā)聲學(xué)習(xí)通路中的輸出核團(tuán)LAMN核團(tuán)的退化有一定的的關(guān)系，這些結(jié)果為了解致聾后聾啞變化可能的機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)資料，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究和探討。本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要增加動(dòng)物樣本量并進(jìn)一步測(cè)定LMAN核團(tuán)的超微結(jié)構(gòu)變化以獲得LMAN核團(tuán)形態(tài)大小的確切變化。