趙光輝，楊 磊，馬建兵，惠曙國(guó)

(1. 西安市紅會(huì)醫(yī)院膝關(guān)節(jié)科，陜西西安 710054；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部護(hù)理學(xué)系，陜西西安 710061)

軟骨下骨是在骨骼發(fā)育成熟后形成的位于關(guān)節(jié)軟骨下的骨板，是關(guān)節(jié)的重要組成部分，包括皮質(zhì)終板、下方的骨小梁結(jié)構(gòu)及其間隙腔和血管[1]。目前，越來(lái)越多的研究已經(jīng)證實(shí)軟骨下骨在骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用[2]，且有研究認(rèn)為在骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨下骨重塑可先于軟骨的退變[3]。大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease, KBD)的典型病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨、骺軟骨和骺板軟骨的變性與壞死[4]，目前其病因與發(fā)病機(jī)制研究主要集中在關(guān)節(jié)軟骨層面。莫東旭等[5]研究發(fā)現(xiàn)，大骨節(jié)病患者軟骨下骨及小梁骨存在明顯的骨結(jié)構(gòu)改變，骨性關(guān)節(jié)面有毛糙和不整的X線征象。MicroRNA(miRNAs)在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程和病理機(jī)制中扮演重要的角色，如其參與軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和軟骨細(xì)胞炎癥等過(guò)程，而且，其可以作為骨性關(guān)節(jié)炎早期診斷的重要生物標(biāo)志物以及治療的潛在分子靶點(diǎn)[6]。本研究通過(guò)比較大骨節(jié)病與骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下骨miRNA的表達(dá)差異，分析顯著性差異的miRNA及其與靶基因的調(diào)控關(guān)系，以期進(jìn)一步明確大骨節(jié)病患者軟骨下骨的損傷特征及其與骨性關(guān)節(jié)炎的異同。

1 材料與方法

1.1 樣本收集4例大骨節(jié)病及4例骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨標(biāo)本均來(lái)自西安市紅會(huì)醫(yī)院接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者。大骨節(jié)病診斷依據(jù)WS/T 207-2010診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，骨性關(guān)節(jié)炎診斷依據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。根據(jù)K-L放射學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，所有大骨節(jié)病和骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)均為4級(jí)。本研究通過(guò)西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本取材前均取得患者及家屬知情同意。

1.2 樣本總RNA提取樣本總RNA提取采用RNeasymini Kit試劑盒進(jìn)行。首先，在液氮中研磨冷凍軟骨下骨組織后進(jìn)行勻漿處理；其次，按照試劑盒操作說(shuō)明依次進(jìn)行裂解和提??；最后，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA溶液的吸光度及其 RNA 的濃度，采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的純度和完整性。

1.3 miRNA芯片分析miRNA表達(dá)譜分析采用Affymetrix公司miRNA 4.0芯片進(jìn)行。首先，采用Genisphere Flash Tag標(biāo)記試劑盒對(duì)樣本總RNA進(jìn)行生物素標(biāo)記；其次，將標(biāo)記的樣品進(jìn)行miRNA微陣列雜交；然后，按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟對(duì)雜交陣列進(jìn)行掃描和分析。

1.4 芯片數(shù)據(jù)分析采用AGCC(Affymetrix Gene Chip Command Console) 軟件對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行背景校正和片間歸一化預(yù)處理，并根據(jù)樣品表達(dá)模式進(jìn)行相關(guān)性聚類分析；采用SAM(Significance Analysis of Microarray)R程序包分析差異表達(dá)miRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為q-value ≤5%且Fold Change ≥2或≤0.5。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析分別采用6種不同程序包括miRWalk、miRanda、miRDB、Pictar2、RNAhybrid和Targetscan對(duì)差異倍數(shù)5倍及以上的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果取其交集；采用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)得到的miRNA及靶基因進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 靶基因生物學(xué)功能和信號(hào)通路分析采用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)6.8軟件對(duì)靶基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)生物學(xué)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異miRNA篩選聚類分析顯示，大骨節(jié)病與骨性關(guān)節(jié)炎兩組miRNA表達(dá)模式明顯不同，提示本研究樣本制備得當(dāng)。共124個(gè)miRNA在大骨節(jié)病軟骨下骨中表達(dá)顯著低于原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎(q-value <0.05, Fold change≤0.5，圖1)。其中，8個(gè)miRNA差異倍數(shù)大于5，分別為hsa-miR-451a、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-629-5p、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-182-5p和hsa-miR-486-5p。

2.2 靶基因預(yù)測(cè)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用不同程序?qū)?個(gè)差異倍數(shù)大于5的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果取交集后得到542個(gè)靶基因(7個(gè)miRNA)，以及1 094個(gè) miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系(圖2)。

圖1 大骨節(jié)病和骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下骨miRNA表達(dá)信號(hào)值的散點(diǎn)圖

綠色表示下調(diào)基因，黑色表示無(wú)顯著差異基因。

2.3 靶基因GO和KEGG分析結(jié)果對(duì)542個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，如表1所示(前5個(gè)最顯著的 GO Term)，靶基因主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和膠原蛋白分解代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程；主要涉及細(xì)胞核、膠原蛋白三聚物和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等細(xì)胞成分；主要分子功能有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活因子活性及RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性結(jié)合等。

進(jìn)一步對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)合富集基因數(shù)及調(diào)整后P值，542個(gè)靶基因顯著富集于20個(gè)KEGG通路(correctedP-value<0.05)，如蛋白質(zhì)消化吸收、黏著斑、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用等(圖3)。

圖2 miRNA與其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2 miRNA and its target gene regulatory network

表1 差異miRNA靶基因GO富集分析結(jié)果(Top 5)

圖3 miRNA靶基因KEGG富集分析結(jié)果

橫坐標(biāo)為-log(校正P值)，縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱。

3 討 論

大骨節(jié)病和原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎均為慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，會(huì)導(dǎo)致患者不可逆的骨與軟骨損傷。在成人大骨節(jié)病患者中，關(guān)節(jié)疼痛和畸形通常發(fā)生在肘關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)等大關(guān)節(jié)中，這些特征與原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎患者相似。但兩種疾病的發(fā)病年齡、癥狀、X線表現(xiàn)不同，提示其病因機(jī)制不同。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨的改變?cè)诠切躁P(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的早期，軟骨下骨會(huì)出現(xiàn)顯微結(jié)構(gòu)的改變，這種結(jié)構(gòu)重塑能夠?qū)е萝浌菗p傷的加速[7]。雖然影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大骨節(jié)病骨及軟骨下骨存在的X線改變征象[8-9]，但關(guān)于大骨節(jié)病軟骨下骨分子機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究miRNA表達(dá)譜分析顯示，大骨節(jié)病和骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨miRNA表達(dá)模式不同，提示兩種疾病軟骨下骨改變的病理機(jī)制不同。

有研究比較了大骨節(jié)病與骨性關(guān)節(jié)炎患者外周血樣本中的差異表達(dá)miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大骨節(jié)病組123個(gè)miRNA表達(dá)不同于骨性關(guān)節(jié)炎患者(108個(gè)上調(diào)和15個(gè)下調(diào))，這些差異miRNA靶基因主要涉及低氧、Wnt受體以及維生素B6生物合成等信號(hào)通路[10]。本研究中大骨節(jié)病軟骨下骨與骨性關(guān)節(jié)炎相比共發(fā)現(xiàn)124個(gè)下調(diào)差異表達(dá)miRNA，其中10個(gè)miRNA在骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下骨硬化區(qū)與非硬化區(qū)比較也出現(xiàn)下調(diào)[11]。其中，部分差異miRNA在骨與軟骨發(fā)育和完整性中具有重要的調(diào)控功能，如靶向SMAD7的miR-17-5p和靶向RUNX2的miR-221被證實(shí)與成骨細(xì)胞的分化調(diào)控有關(guān)[12]；miR-30a-5p在骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨中高表達(dá)，其能夠通過(guò)靶向Akt基因抑制細(xì)胞周期，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[13]。此外，有研究采用高通量測(cè)序技術(shù)比較了小鼠OA模型與正常對(duì)照軟骨下骨miRNA表達(dá)譜，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)10個(gè)差異表達(dá)miRNA，如rno-miR-191a-5p、rno-miR-181a-5p等[14]。但由于在研究中正常人軟骨下骨樣本極難獲得，目前尚未見有關(guān)正常人軟骨下骨miRNA的相關(guān)報(bào)道。

本研究進(jìn)一步對(duì)差異倍數(shù)大于5倍及以上的8個(gè)miRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，這些靶基因參與的部分重要信號(hào)通路涉及骨的發(fā)育和重塑過(guò)程，如PI3K-Akt、MAPK等信號(hào)通路。有研究顯示，在骨性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，PI3K-AKT信號(hào)通路顯著激活，與內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)后脛骨軟骨下骨異常骨形成有關(guān)，而阻斷該通路能夠阻止異常骨形成和減輕軟骨的退變[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號(hào)通路在大骨節(jié)病軟骨中激活，從而參與大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞的凋亡和壞死過(guò)程[16]。這些結(jié)果有助于認(rèn)識(shí)大骨節(jié)病軟骨下骨病變的潛在分子機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)超過(guò)100個(gè)miRNA分子在大骨節(jié)病和骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下骨中差異表達(dá)，提示這些分子可能作為區(qū)分這兩種疾病的分子標(biāo)志物，為大骨節(jié)病與骨性關(guān)節(jié)炎的鑒別診斷提供了新的依據(jù)。通過(guò)進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，初步探索了大骨節(jié)病患者軟骨下骨中miRNA分子的表達(dá)改變及其潛在的調(diào)控關(guān)系。本研究的主要局限在于研究的樣本量相對(duì)較少，可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性；而且，本研究未能比較大骨節(jié)病、骨性關(guān)節(jié)炎與正常對(duì)照軟骨下骨miRNA表達(dá)的差異情況，不能深入分析大骨節(jié)病與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨差異表達(dá)miRNA在疾病發(fā)展中的分子機(jī)制。