幸紅軍,朱明路

遼寧省沈陽市第四人民醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110031

原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥是一種急性自限性傳染病，主要是由EB病毒(EBV)感染所致，發(fā)病后可出現(xiàn)典型的三聯(lián)征，表現(xiàn)為發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大等，多發(fā)于學(xué)齡前和學(xué)齡兒童，尤其是嬰幼兒[1]。多數(shù)患兒預(yù)后較為良好，但也有部分患兒容易出現(xiàn)噬血綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥，影響預(yù)后。臨床上針對該病的診斷主要通過血常規(guī)、EBV抗體檢查、EBV-脫氧核糖核酸(EBV-DNA)檢測等確診，但在實踐中發(fā)現(xiàn)，不同患兒對EBV感染的反應(yīng)不同，出現(xiàn)差異的原因與宿主的免疫反應(yīng)不同有密切聯(lián)系[2]。可溶性白細(xì)胞抗原G(sHLA-G)是機體重要的免疫抑制分子，目前有報道證實，當(dāng)機體被病毒感染后，sHLA-G可在血漿中持續(xù)性高表達(dá)，并對病毒逃逸宿主免疫系統(tǒng)的攻擊具有重要的監(jiān)視作用[3]。但目前關(guān)于其在原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒中的相關(guān)報道仍較少。本研究旨在探討原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年4月至2019年4月本院接診的60例原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并通過臨床癥狀、血常規(guī)、異型淋巴細(xì)胞計數(shù)、EBV抗體、EBV-DNA等檢查得以確診；(2)年齡3個月至3歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天畸形者；(2)臟器功能嚴(yán)重障礙者；(3)惡性腫瘤者；(4)近期接受過相關(guān)治療者；(5)已出現(xiàn)并發(fā)癥者；(6)近3個月內(nèi)使用過激素、免疫抑制劑或增強劑者；(7)無法配合本研究者。并選擇同期本院兒科健康體檢兒童60例作為對照組，本組兒童近半年內(nèi)未發(fā)生病毒感染，年齡3個月至3歲。所有受試者家屬均知情同意本研究，并簽署知情同意書。本研究通過本院倫理委員會審核。

1.2方法

1.2.1一般資料收集 收集所有受試者性別、年齡、身高、體質(zhì)量等一般資料。

1.2.2血清sHLA-G水平檢測 收集兩組受試者清晨空腹靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，混勻后靜置30 min，于室溫下以3 000 r/min的速度離心10 min，置于冷凍箱內(nèi)儲存以備檢測。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進(jìn)行檢測，試劑盒購于捷克Exbio公司。

1.2.3EBV-DNA載量檢測 將靜脈血置于枸櫞酸鈉抗凝管中，使用TaqMan熒光標(biāo)記探針基因擴增技術(shù)(序列為PEEBV5′-XC-CTCGGA-CAGCTCCTAA-GAA GG-CACC-Y-3′，26 bp)進(jìn)行檢測。將各反應(yīng)管置于實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測儀(DA7600型)中，通過下列條件進(jìn)行擴增：分別在若干PCR反應(yīng)管中加入處理后的2 μL樣品上清液，以8 000 r/min的速度離心數(shù)秒置入RT-PCR檢測儀樣品槽中，按對應(yīng)的順序放置陰性質(zhì)控品、陽性定量參考品和準(zhǔn)備檢測的標(biāo)本。于93 ℃的環(huán)境下，預(yù)變性2 min，再變性45 s后在55 ℃的環(huán)境下變性45 s，反復(fù)進(jìn)行30個循環(huán)。試劑盒購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.2.4T淋巴細(xì)胞亞群檢測 將收集至EDTA抗凝管的靜脈血各取100 μL，分別加入帶有相應(yīng)熒光抗體20 μL的試管中，搖勻后于室溫下避光保存15 min，使用標(biāo)本制備儀進(jìn)行自動溶血、固定，采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀(EPICS-XL型)進(jìn)行檢測，檢測指標(biāo)包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料、血清sHLA-G水平和EBV-DNA載量比較 兩組性別、年齡、身高、體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，觀察組血清sHLA-G水平和EBV-DNA載量均明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料、血清sHLA-G水平和EBV-DNA載量比較

2.2兩組T淋巴細(xì)胞亞群比較 觀察組CD3+、CD8+明顯高于對照組(P<0.05)，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.3血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量、T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量呈正相關(guān)(r=0.483，P<0.05)，與T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無相關(guān)性(r=0.029、-0.022、0.017、-0.084，P>0.05)。

表2 兩組T淋巴細(xì)胞亞群比較

3 討 論

EBV-DNA載量檢測是目前診斷原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的重要手段，其可動態(tài)反映EBV感染后的病毒水平，且有助于避免單一檢測易受體液免疫影響的弊端，結(jié)果準(zhǔn)確，已普遍應(yīng)用于該病的診治，具有重要的應(yīng)用價值[5]。近年來，諸多學(xué)者開始關(guān)注細(xì)胞免疫狀態(tài)在原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒中的表達(dá)及意義，并認(rèn)為其在EBV感染過程中有著重要作用[6]。B淋巴細(xì)胞是EBV感染的重要靶細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞在被EBV攻擊后可發(fā)生改變，干擾機體的正常免疫機制，病毒長時間于細(xì)胞內(nèi)潛伏，在一定條件下通過病毒基因、編碼產(chǎn)物等途徑對細(xì)胞基因產(chǎn)生影響，誘發(fā)疾病[7]。KALRA等[8]的研究顯示，原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的臨床癥狀與淋巴細(xì)胞活化具有密切關(guān)聯(lián)，該病的發(fā)生可能和免疫抑制相關(guān)，而不是病毒復(fù)制直接誘發(fā)的。

sHLA-G是機體重要的免疫抑制分子，其可通過各種途徑對CD4+、CD8+等各類免疫細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。目前已有研究證實，sHLA-G對T淋巴細(xì)胞的殺傷功能、NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)、Th細(xì)胞的輔助功能、細(xì)胞因子的釋放等具有抑制作用，而此類功能被抑制也是病毒逃避細(xì)胞免疫的機制[9]。本研究結(jié)果也顯示，在原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒中，sHLA-G水平明顯高于健康兒童，提示在該病患兒中存在著免疫抑制表現(xiàn)。

T淋巴細(xì)胞亞群中，CD3+是反映T淋巴細(xì)胞活化程度的指標(biāo)，CD4+是Th細(xì)胞和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物，Th細(xì)胞可通過釋放多種細(xì)胞因子促進(jìn)B淋巴細(xì)胞、效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的激活，加強機體免疫功能，而CD4+/CD8+則是反映機體免疫功能高低的重要指標(biāo)[10]。本研究結(jié)果顯示，在原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒中，CD3+、CD8+明顯升高，CD4+、CD4+/CD8+明顯降低，提示患兒被EBV感染后，存在著明顯的T淋巴細(xì)胞亞群紊亂表現(xiàn)，機體處于免疫紊亂狀態(tài)。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量呈正相關(guān)，分析患兒被EBV感染后，病毒可侵入細(xì)胞并發(fā)揮作用，對機體的正常免疫機制產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致EBV-DNA載量的升高。但血清sHLA-G水平與T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無相關(guān)性，提示血清sHLA-G的高表達(dá)和原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的免疫功能狀態(tài)無關(guān)，sHLA-G并不直接影響患兒的免疫功能。閆臨漪等[11]研究也顯示，血清sHLA-G可能是和其他因素之間相互協(xié)同致使原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的免疫功能減弱。筆者認(rèn)為也有可能是本研究納入的患兒年齡過小，免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善等因素所致，今后仍需擴大樣本量繼續(xù)研究。

綜上所述，血清sHLA-G水平在原發(fā)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒中明顯升高，且和EBV-DNA載量具有相關(guān)性，但血清sHLA-G水平的升高并不是造成患兒免疫功能降低的直接因素。