侯志梅，劉宸，梁敏，丁雪，王桂玲，馮鑫歡，楊潔

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830063；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；3.米東縣人民醫(yī)院，新疆 米泉 831400)

0 引 言

糖尿病是全球發(fā)病率較高的疾病，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，目前全球糖尿病患者已達(dá)到4.25億人口，而中國(guó)的糖尿病人口數(shù)為全球首位，已經(jīng)達(dá)到了1.1億人且呈上升趨勢(shì)[1]。糖尿病又分為1型糖尿病和2型糖尿病，其中1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，以胰島β細(xì)胞損傷為主要表現(xiàn)[2]。2型糖尿病又稱為胰島素非依賴性疾病，通常由于胰島β細(xì)胞分泌胰島素不足或者靶細(xì)胞對(duì)胰島素不敏感所致，也叫做非胰島素依賴性糖尿病[3]。而胰島β細(xì)胞的主要功能是分泌胰島素，其數(shù)量的減少是造成機(jī)體持續(xù)高血糖的主要原因之一[4]。因此，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖，抑制其凋亡是延緩并減少糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵，也是開(kāi)發(fā)糖尿病治療藥物的重要思路[5]。脂毒性是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡是糖尿病發(fā)病及惡化的重要原因[6]，且棕櫚酸可通過(guò)抑制Akt磷酸化，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生脂毒性，造成細(xì)胞的凋亡[7]；也可通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，影響β細(xì)胞的增殖[8]。研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞的增殖和凋亡方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。目前治療糖尿病主要靠服用α葡萄糖苷酶抑制劑、格列奈、磺脲類藥物和雙胍類藥物，這些藥物可以改善血糖調(diào)節(jié)，但對(duì)患者的健康有一些負(fù)面影響[11]。

駝乳自古以來(lái)就是新疆維吾爾族和哈薩克族人的治病良藥，能夠治療腸胃炎、糖尿病、腎病、肺結(jié)核和肝病等疾病[12]。注射胰島素是治療糖尿病的常見(jiàn)方式，而駝乳中胰島素樣蛋白的含量較高，這也是駝乳相比其它乳制品的優(yōu)勢(shì)之一，不僅如此，駝乳中還富含與胰島素家族相似的半胱氨酸[13]。同時(shí)由于駝乳中的胰島素體積較小以及結(jié)構(gòu)的特殊性，使得它相對(duì)容易成為血液循環(huán)中的一部分，不容易在胃酸中被破壞[14]，這也可能是口服駝乳能夠降低血糖的原因之一。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，駝乳能夠顯著的修復(fù)胰島β細(xì)胞，恢復(fù)其分泌胰島素的功能[15]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型中，胰島β細(xì)胞受到破壞，而攝入駝乳后胰島β細(xì)胞數(shù)量增多[16]。同時(shí)口服駝奶還可以有效預(yù)防高血糖、高血脂和胰島素抵抗等癥狀[17]。且研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠灌胃駝乳清后，血糖水平下降，AKT上調(diào)，降低細(xì)胞的凋亡[18]。但駝乳清對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞株（MIN 6細(xì)胞）機(jī)制尚未清楚。本次研究旨在細(xì)胞水平上探討駝乳清是否能夠?qū)IN 6細(xì)胞的損傷起到保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)其信號(hào)通路的影響作出初步探討，為進(jìn)一步研究駱駝乳治療糖尿病的分子機(jī)制做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MIN 6細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，新鮮駱駝乳購(gòu)自新疆烏魯木齊市紅雁池；胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），BI公司；青霉素-鏈霉素雙抗（Penicillin-Streptomycin，PS），美國(guó)Gibco公司；1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；磷酸緩沖鹽溶液，美國(guó)Hyclone公司；臺(tái)盼藍(lán)，BI公司；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒，碧云天公司；棕櫚酸，北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），Sigma公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DM SO），Sigma公司；0.25%胰蛋白酶，美國(guó)Hyclone公司；聚丙烯酰氨凝膠電泳試劑，北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker（分子量11-245ku），武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗GAPDH單克隆抗體、鼠抗PI3Kp85多克隆抗體、兔抗AKT多克隆抗體、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗，Elabscience公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物，賽國(guó)生物科技有限責(zé)任；TRIzol試劑、FastQuant RT Kit（含gDNase）、SYBR Green PreMix Plus，天根生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Heraeus Multifuge 8R離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；ALPHA 1-2 LD真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin CHRIST公司；MDD-U 53V超低溫冰箱，日本SANYO公司；1300 SERIESA2生物安全柜，賽默飛世爾科技公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱（FORMA DIRECT HEAT），賽默飛世爾科技公司；ELX 808全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek Instruments；Vert.A1熒光倒置顯微鏡，德國(guó)ZEISS公司；BOI-RAD轉(zhuǎn)膜儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像儀，美國(guó)GE公司；Light cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（real-time polymerase chain reaction，PCR），瑞士羅氏公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 駝乳清制備

新鮮乳樣品用尼龍濾布（200目）過(guò)濾除雜，鮮乳4℃下，于5 000 r/min，離心20 min，去脂；10%冰乙酸調(diào)節(jié)p H至4.6，40℃水浴20 min，4℃靜置4 h；5 000 r/min，4℃離心，棄去沉淀（酪蛋白）；留上清液，即乳清；乳清樣品-70℃預(yù)冷過(guò)夜，低溫冷凍干燥后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MIN 6細(xì)胞培養(yǎng)于12%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中。在37℃、5%培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%，棄去培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS清洗2遍后加入0.25%胰酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)輕輕吹打使細(xì)胞均勻分散，取適量細(xì)胞懸液置于新培養(yǎng)瓶中，一般按1∶3比例傳代后放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)程瑞婷[19]等實(shí)驗(yàn)方法上進(jìn)行優(yōu)化，用棕櫚酸分別作用MIN 6細(xì)胞12 h、24 h和36 h，計(jì)算出IC50分別為0.374 mmol/L，0.218 mmol/L和0.117 mmol/L，最后選擇濃度為0.374 mmol/L PA作用于細(xì)胞12 h，構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，即為糖尿病中胰島細(xì)胞損傷模型（DM）。

2.3 MTT法測(cè)量細(xì)胞活性

待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%后加入胰酶消化，消化后將細(xì)胞稀釋制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，150μL/孔接種于96板中，待其貼壁后，棄上清，用含有0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的駝乳清(CW)的培養(yǎng)基，每孔加入200μL進(jìn)行12 h和24 h干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入20μL MTT（終濃度為5 mg/mL）培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加200μL DMSO溶解結(jié)晶顆粒（另設(shè)6個(gè)空白孔），于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。建立M IN 6細(xì)胞損傷模型后，同時(shí)加入含有0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的CW培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)，相同方法測(cè)量細(xì)胞活性。稱取8 mg的駝乳清溶于2 mL的培養(yǎng)基中，其濃度為4 mg/m L，過(guò)濾除菌，再吸取1 mL的4 mg/m L的培養(yǎng)基，不含駝乳清的1 mL新的培養(yǎng)基中進(jìn)行梯度稀釋，后面濃度按照上述方法依次進(jìn)行。

相對(duì)細(xì)胞活力（%）=（試驗(yàn)組OD值-空白OD值）/（正常組OD值-空白OD值）×100%

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

觀察MIN 6細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，建立損傷模型后，加入含有1 mg/mL的CW培養(yǎng)基1 mL/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)干預(yù)12 h后棄去培養(yǎng)基，加入0.5%臺(tái)盼藍(lán)100μL/孔進(jìn)行染色，靜置5 min后，每組隨機(jī)取視野顯微鏡下拍照，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，計(jì)算抑制率：抑制率（%）=處理組染藍(lán)色平均細(xì)胞/對(duì)照組細(xì)胞總數(shù)×100%。相同處理后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。同上述操作培養(yǎng)12 h后，根據(jù)細(xì)胞凋亡Hoechst染色試劑盒相關(guān)使用說(shuō)明進(jìn)行染色并拍照。

2.5 蛋白免疫印跡法

檢測(cè)PI3K和AKT基因相對(duì)表達(dá)RIPA蛋白裂解液裂解提取蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白的濃度后定量，按照比例加入上樣緩沖液，100℃加熱變性。進(jìn)行10%的SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉PVDF膜2 h，將一抗按照1∶1000比例稀釋后，一抗孵育過(guò)夜，于TBST漂洗PVDF膜后，孵育二抗(1∶5000)1 h，再次用TBST和TBS反復(fù)漂洗3次，ELC化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.6 RT-q-PCR

根據(jù)TRIzol提取RNA的方法依次加入氯仿、異丙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液提取RNA，然后根據(jù)FastQuant RT Kit（含gDNase）說(shuō)明書(shū)要求，以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA片段。以cDNA為模板，分別加入PI3K、AKT和GAPDH的特異性引物（序列見(jiàn)表1），按照SYBR Green qPCR PreMix試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法進(jìn)行擴(kuò)增。用2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 qPCR引物序列

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以X±S表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

3 結(jié) 果

3.1 駝乳清對(duì)MIN 6細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的的CW分別作用MIN 6細(xì)胞12 h和24 h，CW對(duì)MIN 6細(xì)胞相對(duì)活力的影響結(jié)果如圖1所示。經(jīng)CW干預(yù)12 h后，細(xì)胞活力均有增加，除4.00 mg/mLCW組細(xì)胞的增殖率較對(duì)照組明顯增加外（P＜0.05），其余各組與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)用不同濃度的CW干預(yù)MIN 6細(xì)胞細(xì)胞12 h和24 h后，細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明CW對(duì)MIN 6細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。

3.2 駝乳清對(duì)棕櫚酸損傷MIN 6細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的CW對(duì)PA損傷后細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)PA干預(yù)12 h后，與對(duì)照組相比，糖尿病組細(xì)胞相對(duì)活力減少38.6%（P＜0.05）。與糖尿病組相比，不同濃度的CW（0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）處理使得相對(duì)細(xì)胞活力分別增加了48.8%、43.4%、31.2%、94.6%、125.4%和33.5%，其中CW 1.00、2.00 mg/mL組與糖尿病組有顯著差異（P＜0.01）。當(dāng)CW和PA作用時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，糖尿病組相對(duì)細(xì)胞活力降低46.6%（P＜0.01）；與糖尿病組相比，CW 0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL組細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力分別增加20.4%、30.2%、57.6%、116.5%、107.9%和82.7%，其中CW 1.00、2.00、4.00 mg/mL組細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力與糖尿病組相比，差異極顯著（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的CW可以減少棕櫚酸對(duì)MIN 6細(xì)胞損害，顯著增加細(xì)胞的活力。

3.3 駝乳清對(duì)棕櫚酸損傷的MIN 6細(xì)胞存活的影響

用CW和PA共同干預(yù)MIN 6細(xì)胞12 h后用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，糖尿病組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，且被染藍(lán)色細(xì)胞數(shù)目增多，臺(tái)盼藍(lán)著色清晰，染色聚集，細(xì)胞抑制率達(dá)到28.6%；CW組細(xì)胞形態(tài)完整，臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞的抑制率為3.6%。表明CW 能夠保護(hù)PA損傷的MIN 6細(xì)胞生長(zhǎng)，具有一定抗損傷活性。

圖1 駝乳清對(duì)MIN6細(xì)胞增殖的影響

圖2 駝乳清對(duì)棕櫚酸損傷的MIN6細(xì)胞增殖的影響

圖3 MIN6細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色

棕櫚酸作用于MIN 6細(xì)胞12 h后，細(xì)胞變小且皺縮，形態(tài)改變。經(jīng)添加CW 1.00 mg/mL和PA對(duì)MIN 6細(xì)胞共同作用12 h后，細(xì)胞損傷明顯減輕，皺縮細(xì)胞較PA損傷的細(xì)胞明顯減少。同樣證明了CW對(duì)MIN 6細(xì)胞的PA損傷具有明顯保護(hù)作用。

圖4 駝乳對(duì)棕櫚酸損傷的MIN6細(xì)胞形態(tài)形態(tài)的影響

3.4 駝乳清對(duì)棕櫚酸損傷的MIN 6細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，糖尿病組可看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核呈致密濃染。CW組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，偶見(jiàn)Hoechst著色細(xì)胞。表明CW具有較好的抗損傷活性，可抑制PA誘導(dǎo)的MIN 6細(xì)胞凋亡。

圖5 MIN6細(xì)胞Hoechst染色200×

3.5 駝乳清對(duì)MIN 6細(xì)胞PI3K/Akt相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

同樣將細(xì)胞處理后，檢測(cè)對(duì)照組、模型組和CW組中MIN 6細(xì)胞PI3K和AKT蛋白質(zhì)相對(duì)內(nèi)參基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)。圖6中結(jié)果顯示MIN 6細(xì)胞損傷后PI3K和AKT蛋白顯著下調(diào)，經(jīng)CW處理后其蛋白表達(dá)量上調(diào)，且差異極顯著（P＜0.01），這說(shuō)明CW對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用可能跟PI3K、AKT的表達(dá)有關(guān)，表達(dá)上調(diào)后能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。

圖6 MIN6細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白表達(dá)結(jié)果（±S，n=3）

3.6 駝乳清對(duì)MIN 6細(xì)胞PI3K/Akt相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

由圖7知，模型組與對(duì)照組相比，PI3K，AKT基因顯著下調(diào)，在加入駝乳清后，基因表達(dá)上調(diào)，且差異極顯著（P＜0.01）。這說(shuō)明CW組分對(duì)M IN 6細(xì)胞有保護(hù)作用，有效減少細(xì)胞凋亡，這可能與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

4 討 論

結(jié)果說(shuō)明，CW能夠有效保護(hù)棕櫚酸損傷后的MIN 6細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，駝乳清可以改善胰島β細(xì)胞的損傷。Hoechst染色也可觀察到，駝乳清組分對(duì)胰島β細(xì)胞有保護(hù)作用，有效減少細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活了PI3K/AKT的表達(dá)。

圖7 MIN6細(xì)胞PI3K、Akt基因的相對(duì)表達(dá)量

糖尿病形成的主要原因是胰島β細(xì)胞損傷，功能逐漸衰退，分泌胰島素能力下降或喪失而導(dǎo)致胰島素絕對(duì)不足，導(dǎo)致血糖升高，危害身體健康，易發(fā)生酮癥酸中毒[20]。因此，保護(hù)胰島β細(xì)胞不受損害，促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖，對(duì)輔助治療糖尿病具有重要意義。駝乳中富含大量礦物質(zhì)、維生素和脂肪以及具有免疫調(diào)節(jié)作用的良好膳食[21-22]。且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明駱駝乳能夠治療糖尿病，修復(fù)胰島β細(xì)胞功能，增強(qiáng)免疫力并能夠有效控制腎病、視網(wǎng)膜病變和傷口愈合等糖尿病并發(fā)癥[23-24]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞一個(gè)重要的信號(hào)通路，在細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡方面發(fā)揮著重要作用[25]。且在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病中，由于炎癥導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞凋亡和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，被證明可能與PI3K/AKT的信號(hào)通路被抑制有關(guān)[26]。PA是一種可以產(chǎn)生胞脂毒性的物質(zhì)，且破壞胰島β細(xì)胞功能，當(dāng)胰島β細(xì)胞受損時(shí)，機(jī)體胰島素分泌不足，導(dǎo)致血液循環(huán)中葡萄糖無(wú)法或較少被肝臟、脂肪組織或肌肉等利用，血糖升高。本次實(shí)驗(yàn)中利用PA構(gòu)建出MIN 6細(xì)胞損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA可誘導(dǎo)MIN 6細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，使MIN 6的細(xì)胞活力下降，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增加；CW具有較好的胰島β細(xì)胞保護(hù)作用，減少PA對(duì)胰島β細(xì)胞MIN 6損傷產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。同時(shí)我們對(duì)其信號(hào)通路作用機(jī)制做出探討，發(fā)現(xiàn)CW調(diào)節(jié)了PI3K/AKT信號(hào)通路，說(shuō)明我們的CW極有可能使通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路來(lái)對(duì)細(xì)胞的凋亡起到抑制作用，能夠保護(hù)胰島β細(xì)胞的損害，促進(jìn)其增殖從而改善糖尿病。

綜上所述，駝乳清作用于棕櫚酸損傷的MIN 6細(xì)胞后，能夠?qū)?xì)胞起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)激活了PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。